三氧化二砷誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株自噬性死亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、國內(nèi)外臨床研究已經(jīng)證實(shí)三氧化二砷(Arsenic trioxide,As<,2>C)可有效地治療復(fù)發(fā)和/或初發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL),并能達(dá)到完全緩解.由于As<,2>O<,3>和化療藥物作用的靶點(diǎn)不同,臨床應(yīng)用時(shí)亦沒有明顯的骨髓抑制;且沒有化療藥物的其他嚴(yán)重毒副反應(yīng).因此,國內(nèi)外研究人員試圖將As<,2>O<,3>應(yīng)用于其他惡性腫瘤的治療.在血液腫瘤方面,許多體外實(shí)驗(yàn)

2、研究表明:As<,2>O<,3>可誘導(dǎo)髓系、淋巴系和漿細(xì)胞等惡性血液病細(xì)胞株凋亡.在臨床研究方面,As<,2>O<,3>已經(jīng)進(jìn)入治療慢性粒細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和骨髓增生異常綜合征(MDS)等疾病的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究.但是As<,2>O<,3>治療淋巴細(xì)胞白血病的研究報(bào)道尚少,其對(duì)淋巴細(xì)胞惡性腫瘤和MDS的作用機(jī)制尚不清楚. 本研究采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,

3、5-diphenyltelra-zoliumbromide)比色法觀察As<,2>O<,3>對(duì)T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4和MDS細(xì)胞株Mutz-1細(xì)胞的生長抑制作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn),As<,2>O<,3>可顯著抑制兩種白血病細(xì)胞株的生長,并呈時(shí)間一劑量依賴性.藥物作用48小時(shí)對(duì)Molt-4細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為4.68μmol/L,對(duì)Mutz-1細(xì)胞的IC50為1.79μmol/L.用碘化丙啶(PI)和AnnexinV對(duì)As<,

4、2>O<,3>處理的白血病細(xì)胞株雙標(biāo)記,流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)結(jié)果顯示Annexin V<'+>、PI<'->細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)呈劑量依賴性增加,提示As<,2>O<,3>導(dǎo)致了白血病細(xì)胞凋亡.同時(shí),FACS分析結(jié)合TUNEL檢測(cè)法表明:As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的死亡細(xì)胞一部分是TUNEL陰性的.熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在細(xì)胞膜沒有破壞的情況下PI能否染色細(xì)胞,結(jié)果顯示:藥物處理48h后,細(xì)胞被PI所標(biāo)記,提示藥物處理能夠?qū)е掳籽〖?xì)

5、胞發(fā)生非凋亡形式的死亡.Western-Blot分析結(jié)果顯示:藥物作用Molt.4細(xì)胞后,啟動(dòng)Caspase蛋白,即Caspase-8和Caspase-9被激活,呈時(shí)間依賴性;Bid也被激活,提示Caspase-9可能通過Bid的激活而被激活.執(zhí)行Caspase蛋白中,Caspase-7呈時(shí)間依賴性激活,而Caspase-3、Caspase-6沒有顯著變化.Caspase抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Pan-caspase抑制劑能部分抑制As<,

6、2>O<,3>誘導(dǎo)的Molt-4細(xì)胞凋亡,而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制劑均不能抑制As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的Molt-4細(xì)胞死亡.應(yīng)用透射電鏡觀察藥物作用前后白血病細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藥物作用后,白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜不完整,胞漿中出現(xiàn)大量囊泡.提示As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的Molt-4和Mutz-1細(xì)胞發(fā)生了自噬性細(xì)胞死亡,有別于細(xì)胞凋亡.磷脂酰肌醇激酶3(Phosphatidylinos

7、itol 3-kinase,P13K/AKT)通路的抑制劑(3-MA)預(yù)育后再和As<,2>O<,3>共同作用于白血病細(xì)胞株(4 μM As<,2>O<,3>作用于Molt-4細(xì)胞48 h, 2μM As<,2>O<,3>作用于Mutz-1細(xì)胞48 h),流式細(xì)胞儀(PI和FSC參數(shù))分析3-MA對(duì)As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的非凋亡細(xì)胞的抑制作用,結(jié)果表明3-MA顯著抑制了非凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生,同時(shí)3-MA顯著增加了細(xì)胞凋亡.用Wester

8、n-blot分析結(jié)果顯示用三氧化二砷作用后的Molt-4細(xì)胞磷酸化的AKT上調(diào),而用3-MA作用后的磷酸化的AKT下調(diào),進(jìn)一步證明As<,2>O<,3>誘導(dǎo)了白血病細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡. 近年來研究發(fā)現(xiàn),自噬性細(xì)胞死亡作為非細(xì)胞凋亡死亡的一種主要方式在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用.但目前對(duì)血液腫瘤的自噬性細(xì)胞死亡及其機(jī)制尚不清楚.Jia等報(bào)道腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株發(fā)生凋亡前有自體吞噬現(xiàn)象發(fā)生.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

9、研究表明,Beclin-1-人類Bcl-2相互作用蛋白基因敲除的小鼠容易發(fā)生上皮細(xì)胞和血液系統(tǒng)惡性腫瘤.Saeki等報(bào)道應(yīng)用Beclin-1反義寡核苷酸處理HL-60細(xì)胞導(dǎo)致了自噬性細(xì)胞死亡.2003年Kanzawa等的研究表明As<,2>O<,3>可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡,但作用機(jī)制還不清楚.這些研究和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示自體吞噬和自噬性細(xì)胞死亡在血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,對(duì)血液腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡及其信號(hào)途

10、徑研究將有可能為血液腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn).我們應(yīng)用Western-blot和定量實(shí)時(shí)RT-PCR研究了As<,2>O<,3>對(duì)白血病細(xì)胞株Beclin-1表達(dá)的影響.結(jié)果表明:在蛋白水平,As<,2>O<,3>顯著上調(diào)了白血病細(xì)胞株Beclin-1的表達(dá),呈時(shí)間和劑量依賴性.而在mRNA水平,As<,2>O<,3>對(duì)Beclin-1的表達(dá)無影響.用蛋白合成抑制劑(CHX)能顯著抑制As<,2>O<,3>對(duì)白血病細(xì)胞株Beclin-1表

11、達(dá)的上調(diào)作用,提示As203對(duì)白血病細(xì)胞株Beclin-1表達(dá)的影響是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的;As<,2>O<,3>可能通過使Beclin-1表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自體吞噬,進(jìn)一步引起自噬性細(xì)胞死亡.由于Bcl-2家族與自體吞噬的發(fā)生有密切關(guān)系,我們進(jìn)一步研究了As<,2>O<,3>對(duì)白血病細(xì)胞株Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果表明:藥物作用后,Molt-4細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào),呈時(shí)間依賴性.Bax蛋白表達(dá)呈時(shí)間一劑量依賴性下調(diào).

12、而Bak蛋白沒有明顯受到影響.為了了解As203影響Molt-4細(xì)胞Bax和Bak表達(dá)的機(jī)制,我們用定量實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)了藥物作用后Bcl-2家族相關(guān)基因mRNA水平的變化;結(jié)果顯示:在mRNA水平,Bax表達(dá)和Bak表達(dá)沒有受到影響.提示As<,2>O<,3>對(duì)Bax的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平. 綜上所述,我們的研究結(jié)果表明:(1)在臨床有效血藥濃度范圍內(nèi),As<,2>O<,3>顯著抑制Molt-4細(xì)胞(2μmol/L-6gm

13、ol/L)和Mutz-1細(xì)胞(1 gmol/L-3μmol/L)的增殖;As<,2>O<,3>對(duì)這兩種白血病細(xì)胞株的生長抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性.藥物作用48小時(shí),Molt-4細(xì)胞的IC50大于4μmol/L;而藥物作用48小時(shí)后Mutz-1細(xì)胞的IC50為1.79μmol/L.表明Mutz-1細(xì)胞株對(duì)三氧化二砷的敏感性高于Molt-4細(xì)胞株. (2)As<,2>O<,3>對(duì)兩種白血病細(xì)胞株有誘導(dǎo)凋亡作用,但也有非凋亡死亡.藥物作用后

14、有Caspase-8和Caspase-9的激活,Bid也被激活,提示Caspase-9可能通過Bid的激活而被激活.執(zhí)行Caspase蛋白中,Caspase-7呈時(shí)間依賴性激活,而Caspase-3、Caspase-6沒有顯著變化.Pan-caspase抑制劑能部分抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的Molt-4細(xì)胞凋亡,而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制劑均不能抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的Molt-4細(xì)胞死亡.(3)Rhodam

15、in123染色表明,藥物作用后細(xì)胞的線粒體膜電位沒有顯著變化;細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和磷脂酰肌醇激酶3抑制劑(3-MA)研究結(jié)果顯示As<,2>O<,3>可誘導(dǎo)Molt-4和Mutz-1細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡.Western blot分析提示As<,2>O<,3>可能通過使Beclin-1蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自體吞噬,進(jìn)一步引起自噬性細(xì)胞死亡.(4)As<,2>O<,3>對(duì)白血病細(xì)胞株Bcl-2家族蛋白表達(dá)也有影響.三氧化二砷作用后,Molt