產單核細胞李斯特菌減毒突變株的構建及其免疫生物學特性的研究.pdf

1、產單核細胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是人獸共患李斯特菌病的病原，主要通過食用被LM污染的食品感染，能引發(fā)人的腦膜炎、發(fā)熱性敗血性胃腸炎、孕婦流產等，感染后發(fā)病死亡率約為25％。歐美國家曾多次暴發(fā)流行，LM對食品的污染與危害，已引起世界各國的普遍關注和高度重視，其中研制預防李斯特菌病的減毒活疫苗是重要的課題之一。另一方面，鑒于LM是胞內寄生菌，減毒LM是非常有前景的疫苗載體之一。為此，本研究通過同源重組的

2、方式對血清型為1/2a的野生型菌株基因組中相鄰的兩毒力基因actA和plcB進行缺失，獲得減毒重組菌株，并以減毒株開展了以原核和真核表達的不同方式運送模式蛋白GFP的研究。為了對減毒株的免疫保護力進行評價，以及從不同水平上證實基因的缺失，對毒力基因hly和actA在大腸桿菌中進行了原核表達并對ActA蛋白進行了單抗的研制。 減毒突變株的獲得不僅對李斯特菌病的預防具有重要作用，而且為構建預防人類和動物疫病的疫苗載體奠定了基礎。此外

3、，對于LM闡明毒力因子的致病機理與免疫保護作用提供了條件。 1.產單核細胞李斯特菌actA基因和hly基因的原核表達及ActA單克隆抗體的研制利用PCR技術從血清型1/2a的LM4株中擴增出actA基因，經(jīng)克隆篩選和測序鑒定后，構建成該基因的原核表達載體pGEX-6P-1-actA及pET-actA，轉入終宿主菌E.coli后，IPTG誘導目的蛋白的表達。SDS-PAGE電泳結果表明，actA基因在兩種載體中均獲得表達，融合蛋白

4、的大小分別約為120KD和97KD。以純化蛋白作為免疫用抗原進行了ActA單抗的研制，獲得四株抗ActA的單克隆抗體雜交瘤細胞株，腹水單抗ELISA效價為1∶5×104～1∶1×105。選取單抗1A5進行Western-blot分析，結果表明不僅能和表達產物進行特異性反應，而且與LM4多抗血清的Western-blot結果一致。這表明表達的ActA蛋白具有免疫生物學活性，同時進一步證實了單抗的特異性。actA基因的原核表達及單抗的研制為

5、研究ActA蛋白的生物學活性及其致病作用奠定了基礎，也為該菌鑒定提供了新試劑。 李斯特菌溶血素(LLO)是產單核細胞李斯特菌的主要毒力因子，利用PCR技術從血清型4b的LM菌株F4636中擴增出編碼LLO的hly基因，經(jīng)克隆篩選和測序鑒定后，構建成該基因的原核表達質粒pGEX-6P-1-hly。SDS-PAGE電泳結果表明：LLO與谷胱甘肽在大腸桿菌中已融合表達，融合蛋白的分子量為82KD；溶血實驗證明融合蛋白具有較強的裂解真核

6、細胞膜的作用，表明表達產物LLO具有生物活性，其溶血效價達2.26×104HU/mg。由于hly基因是LM的高度保守的基因，這為研究血清型為1/2a的菌株激發(fā)機體對LLO的免疫應答水平提供了材料，也為其致病與免疫機理、單抗研制和疫苗設計提供了條件。 2.減毒突變株LM4ΔactA/p/cB的構建及鑒定為了確定用于減毒的產單核細胞李斯特菌菌株，對初篩入選的血清型為1/2a的菌株LM1、LM2、LM3和LM4的分子生物學特性進行了比

7、較研究。利用PCR技術均成功地擴增出4株菌株的hly基因、actA和plcB基因片段。以LD50的測定試驗作為菌株毒力指征，對4株菌株的毒力進行了測定。試驗結果表明：4株菌株均為強毒菌株，其中菌株LM4的毒力最強，對BALB/c小鼠測得的lgLD50為4.19。根據(jù)以上實驗結果確定以LM4作為侯選菌株。 actA和plcB基因的編碼產物ActA和PC-PLC是與其致病性相關的主要毒力因子，本研究通過刪除這兩個基因實現(xiàn)對血清型為1

8、/2a的野生型菌株LM4的減毒。在擴增出待刪除基因兩翼的同源片段actA和plcB后，利用SOEingPCR方法將其拼接在一起，測序后插入穿梭載體pKSV7中，經(jīng)電轉化導入LM4。通過溫度和氯霉素抗性壓力，實現(xiàn)兩次同源重組，對重組克隆用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆命名為LM4ΔactA/plcB。對野生型菌株和突變株的毒力測定結果分別為：菌株LM4的lgLD50為4.19，突變株LM4ΔactA/plcB的lgLD50為7.64，表明

9、刪除了actA和plcB基因之后，菌株的毒力顯著降低。以actA的原核表達產物作為抗原，以重組菌LM4ΔactA/plcB免疫小鼠后制備的多抗血清為一抗進行Western-blot，結果未出現(xiàn)97KD的免疫印記條帶，從蛋白質水平上亦證實了actA基因的缺失。 3.表達GFP的重組減毒突變株的構建利用SOEingPCR的方法把模式蛋白GFP與LLO的啟動子融合在一起，通過同源重組的方式整合到LM4ΔactA/plcB已缺失的act

10、A與plcB基因之間，間接ELISA測定和Western-blot實驗都證實rLM3-GFP在感染小鼠后可原核表達GFP。由此表明LM作為胞內感染菌具備作為外源基因載體的能力。這為開展減毒重組菌與抗原遞呈細胞之間的相互作用及其誘導的免疫應答分析提供了材料。 4.減毒突變株的免疫生物學特性研究以巨噬細胞系、雞胚、小鼠和商品雞為試驗材料，對減毒重組李斯特菌LM4ΔactAlplcB的免疫保護力和安全性進行了系統(tǒng)研究。 細胞侵

11、襲性試驗結果顯示，重組菌侵襲率低于野生型細菌。對雞胚LD50測定結果表明，重組菌lgLD50為5.223，野生型為2.423，半數(shù)致死劑量降低3個數(shù)量級；MTD測定結果顯示以接種劑量中107CFU和106CFU接種的雞胚中，野生型菌株在第四天10枚全部死亡，重組菌僅死亡3枚，由此表明重組菌對雞胚致病力降低。 在小鼠感染模型中，對臟器中LM分布動態(tài)測定結果顯示：重組菌在高于野生型103的劑量尾靜脈注射或高于野生型40倍的劑量下口服

12、免疫后，小鼠臟器中LM的數(shù)量低于野生型免疫組、清除的速度也顯著快于野生型免疫組。對小鼠抗LLO抗體的測定結果表明，重組菌能和野生型細菌同樣激發(fā)較高水平的抗體。在口服和尾靜脈注射免疫后，CD8+T細胞都在第7天達到高峰，且注射免疫方式產生的CD8+T細胞數(shù)量高于口服方式，CD4+T細胞在14天時達到高峰。小鼠免疫保護試驗結果顯示，重組菌免疫組對同種血清型LM的攻毒具有較好的免疫保護力，達到100％。 在商品雞的感染試驗中，重組菌在

13、與野生型細菌相同劑量灌服或胸肌注射后，雞臟器中LM的數(shù)量低于野生型免疫組，被清除的速度也顯著快于野生型免疫組。兩種細菌在以相同的劑量首免和二免免疫雞21天后，對LLO抗體的測定結果表明，減毒菌免疫組雞的抗體水平低于野生型免疫組。但保護力試驗結果顯示，重組菌免疫組對同種血清型LM的攻毒具有較好的免疫保護力，清除細菌的速度顯著快于空白組，對增重不造成影響。 本研究所獲得的減毒突變株具有較好的激發(fā)免疫應答的能力和良好的安全性，可以作為