產(chǎn)單核細胞李斯特菌流行現(xiàn)狀調(diào)查及PFGE分子亞分型分析.pdf

1、本文研究目的是：(1)針對生豬屠宰加工流通各環(huán)節(jié)進行Lm的流行病學(xué)監(jiān)測，了解目前生豬屠宰加工流通中Lm污染率的現(xiàn)狀；對江蘇地區(qū)部分健康羊群和羊圈環(huán)境．Lm的污染率進行初步的調(diào)查研究；(2)建立Lm的PFGE分型方法；(3)應(yīng)用建立的PFGE方法對不同來源的Lm菌株進行分型，完成菌株的相似性距陣分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。 1．產(chǎn)單核細胞李斯特菌的污染狀況調(diào)查 根據(jù)生豬屠宰加工廠生產(chǎn)流程和HACCP系統(tǒng)原理，選擇待宰豬圈環(huán)境、宰

2、前、屠宰過程(腸道)、生鮮豬肉入庫前、冷庫肉、市場銷售生鮮豬肉等六個關(guān)鍵環(huán)節(jié)采集680份樣品進行．Lm的監(jiān)測，檢測方法選用本實驗室建立的基于hly基因的PCR擴增方法。結(jié)果顯示生產(chǎn)流程從宰前到豬肉入庫均未檢測出Lm，而在待宰豬圈環(huán)境、冷庫肉和市場肉樣品中檢測到Lm的存在，污染率分別為1％、3％和6.9％，這就提示加強對豬圈環(huán)境、冷庫環(huán)境定期消毒處理的重要性，市場環(huán)節(jié)的高污染率提示在豬肉進入流通領(lǐng)域后應(yīng)盡可能減少各種外部因素造成的污染或污

3、染加重。采集揚州大學(xué)聯(lián)環(huán)藥業(yè)基因工程有限公司生產(chǎn)基地健康羊群的鼻腔拭和肛拭111份樣品，江蘇海門種羊場健康4月齡小公羊、懷孕母羊、哺乳母羊、哺乳期小羊鼻腔拭樣本和環(huán)境樣本311份，共422份樣品進行Lm的污染狀況調(diào)查。結(jié)果顯示環(huán)境樣品的陽性率最高，達到12.8％，6株Lm中有4株分離自隔離區(qū)環(huán)境，2株分離自羊圈環(huán)境：其次為哺乳母羊鼻腔拭樣品，分離到1株Lm，陽性率為2.1％：懷孕母羊、哺乳小羊、小公羊鼻腔拭樣品的陽性率均為0。此結(jié)果提示

4、應(yīng)該按操作規(guī)程對隔離區(qū)環(huán)境和其它羊圈環(huán)境進行嚴格管理，此外提高干草料的質(zhì)量，減少羊群密度，加強羊只運動也是保證羊群健康的有效措施。 2.產(chǎn)單核細胞李斯特菌脈沖場凝膠電泳分型方法的建立 確定PFGE方法的主要步驟為：細菌包埋瓊脂塊、包埋固定的細菌釋放染色體、包埋塊清洗處理、酶切、脈沖場凝膠電泳和獲得圖譜后進行軟件分析。通過以下幾方面對PFGE方法進行優(yōu)化：細菌的包埋濃度、酶切前包埋塊的處理、包埋塊的清洗過程、酶切時間和酶量

5、、PFGE電泳參數(shù)(轉(zhuǎn)換時間、電泳時間、溫度等)和圖譜的分析方法。通過對參考菌株進行PFGE方法的探索，獲得了條帶亮度和清晰度都較為理想的脈沖圖譜，最終確定了Lm脈沖場分型的一系列最佳條件。(1)細菌的最佳包埋濃度為OD<,610>=1.3(1.25-1.35之間)；(2)細菌在包埋進瓊脂糖之前先用溶菌酶于37℃育處理10分鐘，選用普通低熔點瓊脂糖代替Seakem Gold Agarose(SKG)來包埋細菌，溶菌酶處理后的菌液與低熔點

6、瓊脂糖等體積比混勻制取包埋塊；(3)包埋塊的清洗過程：先用50℃預(yù)熱的超純水、TE各清洗兩次，每次45分鐘，再加入含PMSF的TE液處理30分鐘，最后再用超純水和TE液清洗包埋塊各兩次；(4)酶切過程：選用AscI寡切點酶對細菌染色體進行原位酶切，酶切前增加冰水浴預(yù)處理半小時的步驟，酶用量為2μL/slice(40U/μL)，酶切時間3小時以上：(5)PFGE電泳參數(shù)：場強：6.0V/cm，電場夾角：120°，溫度：12℃，電場轉(zhuǎn)換時間

7、為4.0s-40.0s，電泳時間為22h；(6)使用Quantity One軟件對結(jié)果進行分析，繪制菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹，完成菌株的相似性距陣分析。本文建立的針對Lm的PFGE方法除了具備脈沖分型固有的重復(fù)性好、分辨率高、敏感性強等特點外，針對其存在的耗時、成本高的局限也有較大的改善，縮短了從菌株培養(yǎng)到數(shù)據(jù)獲得的時間，降低了實驗成本，并且對于其它革蘭氏陽性菌PFGE分型方法的探索也具有重要的參考價值，為Lm的溯源追蹤提供了很好的技術(shù)平臺。

8、 3.產(chǎn)單核細胞李斯特菌的耐藥性及PFGE分子亞分型分析 選用15種常用的抗生素，以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，對從食品、環(huán)境、臨床分離到的50株Lm進行抗菌藥物敏感實驗，試驗方法和結(jié)果判讀按美國NCCLs手冊《抗微生物藥物敏感試驗執(zhí)行標準》進行。結(jié)果顯示在50株Lm中，有3個菌株對所有藥物敏感，47個菌株產(chǎn)生了11種耐藥譜。同時對50株不同來源的Lm菌株進行PFGE分型分析，所得結(jié)果以Quantity One軟

9、件繪制菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹，并完成菌株的相似性距陣分析。結(jié)果表明，50株Lm中相似程度最高的為分離自同一市場RTE食品的兩株Lm，相似性系數(shù)達到94.0％。分離自同一市場同類食品以及同一市場新鮮食品和環(huán)境污水的Lm菌株間也顯示了較高的相似性。臨床腦膜炎病人的Lm分離株與分離自市場RTE食品的Lm菌株相似性系數(shù)高達86.8％。本研究還比較了抗生素耐藥譜和PFGE限制性內(nèi)切酶譜，以及PFGE譜和RAPD譜的流行病學(xué)價值，結(jié)果表明PFGE具有分辨