產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌流行現(xiàn)狀調(diào)查及PFGE分子亞分型分析.pdf

1、本文研究目的是：(1)針對(duì)生豬屠宰加工流通各環(huán)節(jié)進(jìn)行Lm的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，了解目前生豬屠宰加工流通中Lm污染率的現(xiàn)狀；對(duì)江蘇地區(qū)部分健康羊群和羊圈環(huán)境．Lm的污染率進(jìn)行初步的調(diào)查研究；(2)建立Lm的PFGE分型方法；(3)應(yīng)用建立的PFGE方法對(duì)不同來源的Lm菌株進(jìn)行分型，完成菌株的相似性距陣分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。 1．產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的污染狀況調(diào)查 根據(jù)生豬屠宰加工廠生產(chǎn)流程和HACCP系統(tǒng)原理，選擇待宰豬圈環(huán)境、宰

2、前、屠宰過程(腸道)、生鮮豬肉入庫(kù)前、冷庫(kù)肉、市場(chǎng)銷售生鮮豬肉等六個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)采集680份樣品進(jìn)行．Lm的監(jiān)測(cè)，檢測(cè)方法選用本實(shí)驗(yàn)室建立的基于hly基因的PCR擴(kuò)增方法。結(jié)果顯示生產(chǎn)流程從宰前到豬肉入庫(kù)均未檢測(cè)出Lm，而在待宰豬圈環(huán)境、冷庫(kù)肉和市場(chǎng)肉樣品中檢測(cè)到Lm的存在，污染率分別為1％、3％和6.9％，這就提示加強(qiáng)對(duì)豬圈環(huán)境、冷庫(kù)環(huán)境定期消毒處理的重要性，市場(chǎng)環(huán)節(jié)的高污染率提示在豬肉進(jìn)入流通領(lǐng)域后應(yīng)盡可能減少各種外部因素造成的污染或污

3、染加重。采集揚(yáng)州大學(xué)聯(lián)環(huán)藥業(yè)基因工程有限公司生產(chǎn)基地健康羊群的鼻腔拭和肛拭111份樣品，江蘇海門種羊場(chǎng)健康4月齡小公羊、懷孕母羊、哺乳母羊、哺乳期小羊鼻腔拭樣本和環(huán)境樣本311份，共422份樣品進(jìn)行Lm的污染狀況調(diào)查。結(jié)果顯示環(huán)境樣品的陽(yáng)性率最高，達(dá)到12.8％，6株Lm中有4株分離自隔離區(qū)環(huán)境，2株分離自羊圈環(huán)境：其次為哺乳母羊鼻腔拭樣品，分離到1株Lm，陽(yáng)性率為2.1％：懷孕母羊、哺乳小羊、小公羊鼻腔拭樣品的陽(yáng)性率均為0。此結(jié)果提示

4、應(yīng)該按操作規(guī)程對(duì)隔離區(qū)環(huán)境和其它羊圈環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格管理，此外提高干草料的質(zhì)量，減少羊群密度，加強(qiáng)羊只運(yùn)動(dòng)也是保證羊群健康的有效措施。 2.產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型方法的建立 確定PFGE方法的主要步驟為：細(xì)菌包埋瓊脂塊、包埋固定的細(xì)菌釋放染色體、包埋塊清洗處理、酶切、脈沖場(chǎng)凝膠電泳和獲得圖譜后進(jìn)行軟件分析。通過以下幾方面對(duì)PFGE方法進(jìn)行優(yōu)化：細(xì)菌的包埋濃度、酶切前包埋塊的處理、包埋塊的清洗過程、酶切時(shí)間和酶量

5、、PFGE電泳參數(shù)(轉(zhuǎn)換時(shí)間、電泳時(shí)間、溫度等)和圖譜的分析方法。通過對(duì)參考菌株進(jìn)行PFGE方法的探索，獲得了條帶亮度和清晰度都較為理想的脈沖圖譜，最終確定了Lm脈沖場(chǎng)分型的一系列最佳條件。(1)細(xì)菌的最佳包埋濃度為OD<,610>=1.3(1.25-1.35之間)；(2)細(xì)菌在包埋進(jìn)瓊脂糖之前先用溶菌酶于37℃育處理10分鐘，選用普通低熔點(diǎn)瓊脂糖代替Seakem Gold Agarose(SKG)來包埋細(xì)菌，溶菌酶處理后的菌液與低熔點(diǎn)

6、瓊脂糖等體積比混勻制取包埋塊；(3)包埋塊的清洗過程：先用50℃預(yù)熱的超純水、TE各清洗兩次，每次45分鐘，再加入含PMSF的TE液處理30分鐘，最后再用超純水和TE液清洗包埋塊各兩次；(4)酶切過程：選用AscI寡切點(diǎn)酶對(duì)細(xì)菌染色體進(jìn)行原位酶切，酶切前增加冰水浴預(yù)處理半小時(shí)的步驟，酶用量為2μL/slice(40U/μL)，酶切時(shí)間3小時(shí)以上：(5)PFGE電泳參數(shù)：場(chǎng)強(qiáng)：6.0V/cm，電場(chǎng)夾角：120°，溫度：12℃，電場(chǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)間

7、為4.0s-40.0s，電泳時(shí)間為22h；(6)使用Quantity One軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，繪制菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹，完成菌株的相似性距陣分析。本文建立的針對(duì)Lm的PFGE方法除了具備脈沖分型固有的重復(fù)性好、分辨率高、敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)外，針對(duì)其存在的耗時(shí)、成本高的局限也有較大的改善，縮短了從菌株培養(yǎng)到數(shù)據(jù)獲得的時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本，并且對(duì)于其它革蘭氏陽(yáng)性菌PFGE分型方法的探索也具有重要的參考價(jià)值，為L(zhǎng)m的溯源追蹤提供了很好的技術(shù)平臺(tái)。

8、 3.產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的耐藥性及PFGE分子亞分型分析 選用15種常用的抗生素，以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，對(duì)從食品、環(huán)境、臨床分離到的50株Lm進(jìn)行抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)方法和結(jié)果判讀按美國(guó)NCCLs手冊(cè)《抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行。結(jié)果顯示在50株Lm中，有3個(gè)菌株對(duì)所有藥物敏感，47個(gè)菌株產(chǎn)生了11種耐藥譜。同時(shí)對(duì)50株不同來源的Lm菌株進(jìn)行PFGE分型分析，所得結(jié)果以Quantity One軟

9、件繪制菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹，并完成菌株的相似性距陣分析。結(jié)果表明，50株Lm中相似程度最高的為分離自同一市場(chǎng)RTE食品的兩株Lm，相似性系數(shù)達(dá)到94.0％。分離自同一市場(chǎng)同類食品以及同一市場(chǎng)新鮮食品和環(huán)境污水的Lm菌株間也顯示了較高的相似性。臨床腦膜炎病人的Lm分離株與分離自市場(chǎng)RTE食品的Lm菌株相似性系數(shù)高達(dá)86.8％。本研究還比較了抗生素耐藥譜和PFGE限制性內(nèi)切酶譜，以及PFGE譜和RAPD譜的流行病學(xué)價(jià)值，結(jié)果表明PFGE具有分辨