Ang-1基因修飾的Nestin陽性骨髓間充質(zhì)干細胞治療脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：(1)分離、培養(yǎng)及鑒定SD大鼠BMSCs，將其誘導分化為Nestin陽性的BMSCs，并通過分子生物學技術(shù)將Ang-1基因轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)；(2)構(gòu)建SD大鼠T10脊髓鉗夾損傷模型，評估其可行性；(3)通過Ang-1基因修飾的Nestin陽性BMSCs局部注射對損傷脊髓進行治療，檢測Nestin陽性的BMSCs是否能夠分化為神經(jīng)元細胞，檢測Ang-1對移植入體內(nèi)的Nestin陽性的BMSCs，新生及損傷后殘留的神經(jīng)元細胞是否具有保護作

2、用。
　　 方法：(1)采用全骨髓差速貼壁分離培養(yǎng)法將SD大鼠雙后肢股骨、脛骨骨髓內(nèi)的BMSCs進行分離培養(yǎng)。通過顯微鏡下觀察細胞生長性狀；流式細胞儀檢測其細胞表面標志物CD29、CD34、CD45和CD90的表達；向成骨樣細胞、成脂肪樣細胞及成神經(jīng)樣細胞分化證明其具有多向分化潛能；同時將BMSCs誘導分化為Nestin陽性的BMSCs，并通過腺病毒載體將Ang-1基因轉(zhuǎn)染入Nestin陽性的BMSCs中，Weston blot

3、檢測轉(zhuǎn)染后的細胞是否表達Ang-1。(2)構(gòu)建SD大鼠T10脊髓鉗夾損傷模型，造模后1周內(nèi)通過運動功能評價、神經(jīng)電生理檢測及組織病理學檢測等方法檢測模型的可行性；(3)造模后1周對隨機分組的大鼠實施局部注射移植細胞進行治療，在隨后的1～4周內(nèi)通過運動功能評價、神經(jīng)電生理檢測及脊髓組織的免疫組織化學檢測等方法檢測Ang-1基因修飾的Nestin陽性BMSCs對損傷后脊髓的相關(guān)作用。
　　 結(jié)果：(1)通過全骨髓差速貼壁分離培養(yǎng)的B

4、MSCs增殖速度快，擴增能力強，傳代培養(yǎng)3代后細胞可獲較高純度；通過流式細胞儀檢測細胞表面標記物，細胞表達CD29和CD90，陽性率均達99％以上；在體外通過誘導分化后細胞可分化為成骨細胞、成脂肪細胞及成神經(jīng)樣細胞；通過Weston blot檢測轉(zhuǎn)染后的Nestin陽性BMSCs出現(xiàn)Ang-1條帶。(2)造模后1周內(nèi)，大鼠出現(xiàn)明顯截癱(BBB＜4分)，經(jīng)神經(jīng)電生理檢測無法引出CSEP波形，脊髓組織出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，脊髓空泡變性。(3

5、)移植后1～4周，A組大鼠后肢神經(jīng)功能無明顯變化，B、C組大鼠均有不同程度的恢復，C組較B組明顯(P＜0.05)；神經(jīng)電生理檢測，C組亦明顯優(yōu)于B組(P＜0.05)；損傷脊髓經(jīng)免疫組織化學染色后，B、C兩組均表達BrdU、Nestin、NSE，隨著時間的延長，陽性細胞數(shù)逐漸減少，但移植4周后C組仍保持一定量的陽性細胞，且明顯多于A、B兩組(P＜0.05)。C組還可觀察到BrdU陽性細胞向血管腔周圍聚集。
　　 結(jié)論：(1)通過全

6、骨髓差速貼壁分離培養(yǎng)法能夠獲取較高純度的BMSCs，細胞具有多向分化潛能，經(jīng)神經(jīng)誘導后，細胞能分化為Nestin陽性BMSCs，通過分子生物學技術(shù)，Ang-1基因轉(zhuǎn)染入Nestin陽性BMSCs中獲得成功。(2)成功構(gòu)建SD大鼠T10脊髓鉗夾型損傷模型。(3)經(jīng)Ang-1基因修飾后的Nestin陽性BMSCs移植入體內(nèi)后能進一步分化為成熟的神經(jīng)元細胞，同時其分泌的Ang-1對Nestin陽性的BMSCs、新生及殘留神經(jīng)細胞具有保護作用，