聯(lián)合應用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和維甲酸預誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療全橫斷脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、本研究旨在探討聯(lián)合應用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和維甲酸預誘導骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷，能否促進損傷后結構和功能的恢復，并分析其中可能的作用機制，為臨床上治療急性脊髓損傷提供新的治療策略和實驗依據(jù)。本研究分為以下四部分： (一)、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外分離培養(yǎng)、純化及其分化潛能檢測 目的：建立一套成熟而穩(wěn)定的大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)方法，為本課題后面的研究提供穩(wěn)定的細胞來源。 方法：

2、選取幼年雄性SD大鼠股骨全骨髓細胞，采用全骨髓培養(yǎng)法進行體外培養(yǎng)，通過不斷傳代對。MSCs進行純化；體外在成骨細胞誘導液的作用下誘導MSCs向成骨方向分化，并用茜素紅染色顯示鈣結節(jié)的形成；而在脂肪誘導液和脂肪維持液的交替作用下，誘導MSCs向脂肪細胞分化，并用油紅染色顯示含有脂滴的脂肪細胞。 結果：MScs當傳至第3代時形態(tài)較均一，基本純化；而傳到6代以后，其增殖能力明顯減弱。MSCs在成骨誘導培養(yǎng)液的作用下，能形成明顯的鈣

3、結節(jié)；而在成脂誘導培養(yǎng)液的作用下，能形成含有脂滴的脂肪細胞。 結論：建立成熟而穩(wěn)定的大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)方法，同時培養(yǎng)的MSCs具有向成骨、成脂方向分化的潛能。 (二)、NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞及其表達產(chǎn)物的檢測 目的：利用重組腺病毒載體，在體外獲得穩(wěn)定的NT-3基因轉(zhuǎn)染的骨髓MSCs，為后面的體內(nèi)、外研究奠定良好的基礎。 方法：含有LacZ基因和人NT-3基因

4、的重組腺病毒(AdvLacZ和AdvNT-3)在HEK293細胞中擴增，結合氯化銫梯度超速離心和透析對重組腺病毒載體進行純化，并利用終端稀釋度測定法進行病毒滴度的測定；選用P3～P5代MSCs，利用不同MOI值的AdvLacZ體外進行轉(zhuǎn)染，通過X-Gal組織化學染色，可計算出AdvLacZ在MSCs中的轉(zhuǎn)染效率，并從中選擇最合適的MOI值；利用這個MOI值的AdvNT-3轉(zhuǎn)染MSCs和經(jīng)RA預誘導后的MSCs，并通過NT-3免疫熒光組織

5、化學染色檢測轉(zhuǎn)染后的MSCs是否有NT-3的表達；同時利用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染NT-3基因后的MSCs(無論有沒有進行RA預誘導)，在轉(zhuǎn)染后第4d、第7d和第14d 24h內(nèi)分泌NT-3的量。 結果：通過腺病毒的擴增和純化，我們獲得了高滴度的NT-3基因和lacZ基因的重組腺病毒。利用不同MOI值的AdvlacZ感染MSCs，發(fā)現(xiàn)當MOI為300時，腺病毒能有效地感染MSCs，轉(zhuǎn)染效率可達到47％。未經(jīng)AdvNT-3轉(zhuǎn)染的MSC

6、s不能產(chǎn)生和分泌NT-3，我們用MOI為300的AdvNT-3感染MSCs 48h后，免疫熒光組化染色結果表明有30％的MSCs可表達NT-3。ELISA結果顯示，經(jīng)AdvNT-3轉(zhuǎn)染后，MSCs在體外至少1w內(nèi)能維持NT-3高水平的分泌，在2w時仍有NT-3的分泌。MSCs在經(jīng)過10<'-6>mol/L RA的預處理48h后，同樣能有效的被腺病毒轉(zhuǎn)染。而且RA的預處理似乎能增加MSCs NT-3的表達率(60％)和在第4d和第7d N

7、T3的分泌量。 結論：在體外較穩(wěn)定地獲得了NT-3基因轉(zhuǎn)染的MSCs；RA預處理能增強NT-3基因轉(zhuǎn)染的MSCs表達和分泌NT-3。 (三)、聯(lián)合應用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和維甲酸預誘導促進培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化 目的：探討一種可行的方式聯(lián)合RA和NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染，通過使MSCs自分泌或旁分泌NT-3，在體外能促進MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化。 方法：P3～P5代MSCs先經(jīng)10<'

8、-6>mol／LRA預誘導48h后，進行AdvNT-3的轉(zhuǎn)染，同時設立了MSCs對照組、LacZ基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs組、NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs組和RA誘導MSCs組；在轉(zhuǎn)染3d后，應用免疫熒光組織化學染色方法檢測不同組中各種神經(jīng)細胞標志物的表達；同時應用半定量RT-PCR技術檢測各組。MSCs中TrkC mRNA的表達水平。 結果：與其它組相比，聯(lián)合應用RA和AdvNT-3可顯著增加NF和MAP2的表達率(46

9、.5％和48.4％)，同時能促進MSCs中PSD95的表達(22.1％)。只有當MSCs經(jīng)過RA處理后，不管有沒有加上NT-3基因重組腺病毒的轉(zhuǎn)染，能顯著提高nestin的表達。所有的處理都不能引起MSCs中GFAP的表達。同時僅僅在聯(lián)合RA的預誘導和AdvNT-3的轉(zhuǎn)染組能引起MSCs中TrkC mRNA的表達。 結論：聯(lián)合應用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和RA預誘導能促進大鼠骨髓MSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元分化。

10、 (四)、聯(lián)合應用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和維甲酸預誘導的骨髓問充質(zhì)干細胞移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實驗研究 目的：探討聯(lián)合應用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和RA預誘導的MSCs移植對大鼠全橫斷脊髓損傷后結構和功能修復的影響。 方法：建立大鼠全橫斷脊髓損傷的動物模型，損傷后立即向橫斷處分別移植MSCs，RA誘導的MSCs、LacZ基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染的MSCs、NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染的MSCs和聯(lián)合NT-3基因重組腺

11、病毒轉(zhuǎn)染和RA預誘導的MSCs，存活60d后，進行BBB評分和爬網(wǎng)格測試。然后在離橫斷處下方1個節(jié)斷處注射熒光金(FG)再存活7d，進行電生理檢測，然后取材、切片并進行免疫熒光組織化學染色等形態(tài)學檢測。 結果：各組MSCs移植2個月后在脊髓損傷處能存活和遷移，而與其它移植組相比，聯(lián)合NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和RA預誘導MSCs移植能促進脊髓損傷處移植的MSCs分化為神經(jīng)元及具有形成突觸潛能的神經(jīng)元。重組腺病毒載體攜帶的外源基因

12、(LacZ基因和NT-3基因)轉(zhuǎn)染MSCs后移植到大鼠全橫斷脊髓損傷處，2個月后脊髓損傷處仍有外源基因的表達。與其它移植組相比，聯(lián)合NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和RA預誘導MSCs移植2個月后能促進全橫斷脊髓損傷大鼠宿主脊髓內(nèi)髓鞘的恢復與重建；能明顯抑制脊髓損傷處CSPGs的表達，而促進laminin的表達；能明顯促進大鼠全橫斷脊髓損傷處神經(jīng)纖維軸突的再生，并有再生的神經(jīng)纖維通過脊髓橫斷處；能促進全橫斷脊髓損傷大鼠宿主神經(jīng)元的存活(大腦皮