片形吸蟲及其分泌排泄產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞極化和宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答作用的研究.pdf

1、片形吸蟲的兩個(gè)致病種大片形吸蟲和肝片形吸蟲均能感染人和哺乳動(dòng)物引起片形吸蟲病，不同宿主的易感性不同，這與片形吸蟲對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控或逃避有關(guān)。肝片形吸蟲及其ESP已被證實(shí)能誘導(dǎo)小鼠和牛巨噬細(xì)胞的M2型極化，而大片形吸蟲在宿主中能否引起相似的免疫反應(yīng)尚無明確的結(jié)論。本研究旨在通過體內(nèi)外試驗(yàn)探討大片形吸蟲及其ESP在不同宿主引起的巨噬細(xì)胞極化和固有免疫反應(yīng)的差異及其免疫機(jī)制，并將淋巴插管模型應(yīng)用于片形吸蟲ESP對宿主免疫細(xì)胞的作用研究，以

2、探明片形吸蟲及其ESP對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，為理解大片形吸蟲與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供可靠的理論基礎(chǔ)。本研究取得以下成果:
　　1.用大片形吸蟲囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6)，分別于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周處死。通過肝組織切片觀察到水牛和小鼠肝臟均能從炎癥浸潤向結(jié)締組織增生轉(zhuǎn)歸，水牛感染14周可見肝內(nèi)肉芽組織和成蟲形成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟枯否細(xì)胞

3、（巨噬細(xì)胞）分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量，并用ELISA檢測血清IFN-γ和IL-4，結(jié)果顯示:隨著感染病程的加劇水?？莘窦?xì)胞表型從M2型極化向M1、M2型共上調(diào)的趨勢轉(zhuǎn)變，KM小鼠枯否細(xì)胞表型則由前期的M1+M2混合型向M0型轉(zhuǎn)歸，而B6小鼠則表現(xiàn)為更明顯的M2型極化。結(jié)果表明:大片形吸蟲感染水牛和小鼠可誘導(dǎo)肝臟KC表型和細(xì)胞因子的表達(dá)變化存在較大宿主差異，這些變化的宿主差異是與不同宿主肝臟的載蟲能力、損傷修復(fù)能力、病變程度以及蟲

4、體在宿主體內(nèi)移行、發(fā)育密切相關(guān)的。
　　2.用大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠，4天、7天隔日注射作為短期試驗(yàn)組，14周每周注射作為長期試驗(yàn)組，注射PBS為對照。通過肝組織切片觀察到FgESP腹腔短期注射不會(huì)引起小鼠肝臟明顯的組織學(xué)變化，而長期注射會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、結(jié)締組織增生和纖維化趨勢。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟枯否細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示:KM小鼠

5、短期注射FgESP會(huì)引起肝組織iNOS mRNA表達(dá)下調(diào)，但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表達(dá)上調(diào)，兩種小鼠枯否細(xì)胞均表現(xiàn)出M2型極化優(yōu)勢;兩種小鼠長期注射FgESP則引起完全不同的KCs表型趨勢，其中KM小鼠表現(xiàn)為M1和M2型同時(shí)上調(diào)的混合型，B6則表現(xiàn)為M1和M2均沒變化的M0型。
　　3.用200μg/mL大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FgESP體外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠來源的傳代iPMΦ（野生型）兩類MΦ48小

6、時(shí)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定兩類巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量，化學(xué)法測定細(xì)胞Arg-1，Griess法測定細(xì)胞上清NO濃度，ELISA測定上清IFN-γ、IL-4濃度，結(jié)果顯示:水牛BLMΦCD68基因表達(dá)下調(diào)、Arg-2基因表達(dá)上調(diào)，Arg-1、NO的合成增加，上清中的IFN-γ濃度下降、IL-4沒有明顯變化，提示可能存在M2型極化和細(xì)胞激活的抑制或凋亡的發(fā)生;小鼠野生型iPMΦA(chǔ)rg-1合成增加，上清中的IL-4濃度顯

7、著升高，而IFN-γ、NO濃度沒有變化，也提示M2型極化。結(jié)果表明:FgESP體外刺激不同宿主MΦ均能誘導(dǎo)M2型極化。
　　4.用200μg/mL FgESP分別體外刺激B6小鼠來源的基因敲除iPMΦ（MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-），測定上清NO、IFN-γ、IL-4濃度和細(xì)胞裂解物的Arg-1含量，并與野生型iPMΦ進(jìn)行比較，結(jié)果顯示:MyD88的缺失導(dǎo)致IL-4的分泌與對照組無差異，而My

8、D88、TRIF同時(shí)缺失導(dǎo)致IL-4的分泌減少，兩者均低于野生型iPMΦ;無論是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-還是TLR-2/4-/-iPMΦ，F(xiàn)gESP體外刺激誘導(dǎo)的Arg-1產(chǎn)量均與對照組無差異。結(jié)果表明:FgESP體外刺激小鼠傳代巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)依賴于MyD88及其相關(guān)通路的M2型激活，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)Arg-1合成和NO分泌抑制，而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某種方式發(fā)揮作用。
　　5.

9、通過外科手術(shù)成功構(gòu)建綿羊的股骨前偽輸入淋巴插管、肝臟輸入淋巴插管，成功率分別為約70％和33％左右。
　　6.將200μg熒光標(biāo)記的肝片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FhESP于綿羊股骨前區(qū)域多點(diǎn)皮下注射（OVA設(shè)為對照抗原），并通過股骨前偽輸入淋巴插管收集0～7天不同時(shí)間點(diǎn)的淋巴液并分離免疫細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞種類和抗原吞噬細(xì)胞的比例，熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志mRNA表達(dá)量，ELISA測定淋巴液的IFN-γ和IL-

10、4，結(jié)果顯示:FhESP注射刺激能使股骨前輸入淋巴中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的比例分別在注射后4～8小時(shí)和8～12小時(shí)特異性升高，淋巴細(xì)胞的比例在注射后4～8小時(shí)特異性降低，DCs的比例在注射后4～8小時(shí)升高但與OVA對照抗原相比缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的比例在各時(shí)間點(diǎn)無明顯改變;抗原吞噬細(xì)胞的數(shù)量在注射后4～12h的短暫提高，其中，嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞對FhESP的早期吞噬具有特異性，但DCs的兩個(gè)亞群

11、的比例變化不具抗原特異性;FhESP刺激能導(dǎo)致淋巴液分離到的細(xì)胞M2型分子標(biāo)志CD206、Arg-2和YM-1的表達(dá)均在刺激后24小時(shí)內(nèi)特異性上調(diào)，淋巴液IL-4在0～8h特異性升高，IFN-γ、IL-10、IL-12的含量沒有特異性變化。結(jié)果表明:綿羊股骨前偽輸入淋巴插管操作簡單，成功率高，適用于免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，通過該模型我們發(fā)現(xiàn)FhESP能在綿羊體內(nèi)促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的快速招募，提高吞噬細(xì)胞抗原吞噬能力，特異性誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞

12、M2型極化和Th2細(xì)胞因子分泌。
　　綜上所述，本文認(rèn)為大片形吸蟲感染導(dǎo)致肝臟枯否細(xì)胞表型極化趨勢和細(xì)胞免疫應(yīng)答趨勢存在較大的宿主差異，主要取決于宿主肝臟的載蟲能力、損傷修復(fù)能力和病變進(jìn)程。大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FgESP則能在體、內(nèi)外誘導(dǎo)動(dòng)物宿主巨噬細(xì)胞依賴于MyD88信號通路的M2型極化，并刺激分泌Th2型細(xì)胞因子，通過上調(diào)Arg-1抑制NO分泌降低巨噬細(xì)胞清除病原的能力，可能是大片形吸蟲逃避巨噬細(xì)胞免疫殺傷的策略。此外，在綿