質(zhì)膜蛋白3參與的真菌耐多烯類(lèi)AmB機(jī)制研究.pdf

1、深部真菌感染是一種致病性真菌侵犯皮下組織和器官所引起的真菌感染性疾病，其死亡率較高且難以治療。兩性霉素B(Amphotericin B，AmB)是一種有效治療深部真菌感染的臨床用藥，但隨著AmB使用的增多，耐藥性問(wèn)題日漸嚴(yán)峻，而且耐藥菌株的分子機(jī)制并不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明質(zhì)膜蛋白3（PMP3p）高表達(dá)增加了細(xì)胞對(duì)AmB的抗性，但PMP3與AmB相關(guān)性的研究還很少。本文開(kāi)展質(zhì)膜蛋白3在釀酒酵母(Saccharomyces cerev

2、isiae)和白色念珠菌（Canidia Albicans）中參與的耐AmB機(jī)制研究。
　　文獻(xiàn)研究表明AmB的作用機(jī)制主要有兩種：一種是通過(guò)與甾醇結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)膜形成孔洞，胞內(nèi)物質(zhì)外流，造成細(xì)胞死亡；一種是AmB能增加細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，造成細(xì)胞死亡。因此，首先，本文通過(guò)PI染色質(zhì)完整性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和羅丹明123吸收和外排實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PMP3能增加細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性。因PMP3，最早是在植物中發(fā)現(xiàn)的，且對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)離子的平衡有重要作

3、用。因此我們探究了在酵母中，PMP3調(diào)控兩性霉素B抗性與離子的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明PMP3對(duì)Na+的平衡起重要作用，而與K+和Ca2+沒(méi)有相關(guān)性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，PMP3調(diào)節(jié)AmB的抗性與NHA1和VCX1通路是無(wú)關(guān)的。
　　其次，我們?cè)阽薮己铣赏纷钄嗟耐蛔凅w（erg2△，erg6△，erg24△，hmg1△和hmg2△）中超表達(dá)PMP3基因也能夠提高細(xì)胞對(duì)AmB的抗性，說(shuō)明阻斷甾醇合成通路并不影響PMP3調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)AmB的抗性。進(jìn)一步研

4、究在野生型（BY4741）及不同遺傳突變菌株中過(guò)表達(dá)PMP3甾醇含量沒(méi)有顯著變化。這表明PMP3不是通過(guò)調(diào)控甾醇的合成來(lái)影響細(xì)胞對(duì)AmB的抗性。
　　最后，研究了PMP3與藥物誘導(dǎo)的氧化脅迫之間的關(guān)系。結(jié)果表明AmB能造成細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加，使細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（TBRAS）和蛋白羰基含量（CP）增加。并且抗氧化相關(guān)的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Gpx)活性也增加，超表達(dá)PMP3能使

5、細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶合成升高，降低了細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量，從而保護(hù)了細(xì)胞，這表明超表達(dá)PMP3能提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶降低胞內(nèi)活性氧來(lái)增加細(xì)胞對(duì)AmB的抗性。同時(shí)，已有研究表明細(xì)胞內(nèi)ROS的降低不僅與抗氧化酶有關(guān)，而且與MAPK通路有密切的關(guān)系。我們進(jìn)一步研究表明，MAPK通路的中的關(guān)鍵基因SPC1和ATF1缺失的情況下（atf1△和spc1△），超表達(dá)PMP3不表現(xiàn)AmB抗性，也不能降低細(xì)胞內(nèi)活性氧；PT-PCR的檢測(cè)細(xì)胞PMP3表達(dá)水平與AmB