在不動桿菌對碳青霉烯類耐藥機制中外排泵及外膜蛋白表達作用的研究.pdf

1、[目的]探索在體外碳青霉烯類抗菌藥物選擇性壓力作用下導致的耐藥突變菌株中,主動外排泵系統(tǒng)及外膜蛋白表達對碳青霉烯類耐藥所起的作用。
　　 [方法]從SEANIR監(jiān)測瓊脂稀釋法藥敏數據庫中選擇碳青霉烯類敏感的不動桿菌,用ARDRA技術對菌株進行分子水平上的鑒定。將入選的親代敏感菌株在體外亞胺培南、美羅培南碳青霉烯類抗菌藥物選擇性壓力作用下,篩選出碳青霉烯類耐藥突變菌株,并用ARDRA對其進行鑒定。通過RAPD、PFGE、Diver

2、silab和MLST4種分型方法對親代敏感菌株和耐藥突變株進行同源性分析。選擇遺傳背景密切相關而碳青霉烯類耐藥表型不同的親代敏感菌株和其耐藥突變菌株,用瓊脂稀釋法對其進行藥物敏感性實驗；另外,與藥物敏感性實驗同步進行,在抗菌藥物中加入外排泵抑制劑氰氯苯腙(CCCP),觀察其對實驗菌株MIC的影響,初步探索耐藥突變菌株是否存在主動外排泵系統(tǒng)；用普通PCR和基因測序的方法對常見碳青霉烯酶及其插入序列、整合子、外排泵及其調節(jié)基因、外膜蛋白ca

3、rO基因進行分析；用SDS-PAGE電泳檢測不動桿菌外膜蛋白表達情況；并用實時熒光定量PCR檢測不動桿菌主要外排泵系統(tǒng)AdeABC及其調節(jié)基因和carO基因的表達水平。
　　 [結果]本研究入選的6株碳青霉烯類敏感的不動桿菌,ARDRA鑒定為4株2型鮑曼不動桿菌、1株基因組3型不動桿菌和1株13TU型不動桿菌,各菌株的亞胺培南和美羅培南耐藥突變菌株ARDRA結果與親代菌株一致。從亞胺培南和美羅培南體外篩選耐藥菌株的過程可以得出:

4、美羅培南更容易誘導出耐藥菌株,但其誘導的美羅培南耐藥菌株大多對亞胺培南敏感,而亞胺培南誘導的耐藥菌株,對美羅培南表現(xiàn)為高耐的現(xiàn)象。PFGE、RAPD、Diversilab和MLST4種分型方法的結果顯示:每株菌的親代敏感菌株和其體外選擇耐藥突變株同源性密切相關；RAPD和Diversilab的分辨力比PFGE差,不能區(qū)分親緣關系相近的菌株,pu61親代敏感菌株及其耐藥突變菌株與pu53親代敏感菌株及其耐藥突變菌株RAPD和Diversi

5、labDNA顯示密切相關,但PFGE顯示兩株菌間相差7個條帶以上,無親緣關系；MLST雖然基因組3型不動桿菌gdhB和gpi PCR擴增或測序失敗,但與其他分型方法相比,表現(xiàn)為遺傳背景一致的菌株具有相同的ST型。rpoD非簡并引物對基因組3型不動桿菌和基因組13TU型不動桿菌擴增效果不好。體外篩選的碳青霉烯類耐藥不動桿菌呈現(xiàn)多重耐藥表型,僅對粘菌素、米諾環(huán)素表現(xiàn)為很好的抗菌活性,耐藥率≤2％,碳青霉烯類抗菌藥物的抗菌活性亞胺培南>美羅培

6、南。亞胺培南和美羅培南E-test法和瓊脂稀釋法藥敏結果相差在2個稀釋濃度范圍內,但最終判定的藥敏表型一致。CCCP可以降低抗菌藥物的MIC,加入CCCP后各抗菌藥物的耐藥率均有不同程度的下降,外排泵表型陽性菌株分布中耐藥菌株所占構成比率最高。統(tǒng)計學分析CCCP對抗菌藥物敏感性的影響,結果顯示美羅培南、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟和哌拉西林-他唑巴坦加入和不加入CCCP兩組藥物敏感性表型構成比具有統(tǒng)計學差別,p值均<0.01。

7、22株親代敏感菌株和耐藥突變菌株,除鮑曼不動桿菌表達OXA-51外,均不表達碳青霉烯酶和插入序列,少數幾株菌表達ESBLs和存在Ⅰ類整合子,但整合子只攜帶了對氨基糖甙類、磺胺和消毒劑耐藥的基因。AdeABC外排泵系統(tǒng)完整性及adeR、adeS、和adeB內部保守序列的序列分析顯示各菌株的親代敏感菌株和其耐藥突變菌株具有相同的特點?；蚪M13TU型不動桿菌表達adeB泵基因。22株細菌AbeMN外排泵系統(tǒng)均陽性,AdeDE外排泵系統(tǒng)均陰性

8、,包括基因組3型不動桿菌。基因組3型不動桿菌缺失carO基因,其他菌株carO基因全長序列分析沒有發(fā)現(xiàn)插入序列。SDS-PAGE電泳顯示zj69亞胺培南和美羅培南篩選的耐藥突變菌株與其敏感菌株相比外膜蛋白表達無明顯差別,另外5株不動桿菌美羅培南中介或耐藥菌株與其各自敏感菌株相比,均表現(xiàn)為31.6kDOMP表達減弱或缺失。硅膠柱DNaseⅠ消化提取的RNA無基因組DNA的污染,且質量和濃度均滿足后續(xù)實驗。內參基因16S rRNA及各目的基

9、因的標準曲線均滿足相關系數r的絕對值>0.98,斜率在-3.0～-3.5之間。擴增曲線呈標準的S形曲線,融解曲線分析各個基因均呈現(xiàn)特征性的峰圖,無非特異產物或引物二聚體。熒光定量PCR雙標準曲線法相對定量分析顯示,相對于16srRNA內參基因,除個別碳青霉烯類耐藥菌株外,外排泵系統(tǒng)adeB、adeR和adeS基因的表達量均有不同程度的上升,而carO基因的表達量有不同程度的下降。
　　 [結論]亞胺培南和美羅培南兩種碳青霉烯類藥

10、物體外誘導不動桿菌耐藥的能力不同,可能兩者在體外誘導不動桿菌耐藥方面存在不同的機制,或具有相同的耐藥機制,但對介導兩種碳青霉烯類藥物耐藥的特異性程度不同。普通PCR和基因測序對常見的耐藥決定因子進行分析,排除了由碳青霉烯酶、外排泵基因突變和carO基因插入失活等耐藥機制。外排泵抑制作用實驗結果顯示美羅培南組有統(tǒng)計學意義,提示可能外排泵對美羅培南的特異性程度高；熒光定量PCR顯示亞胺培南和美羅培南耐藥突變菌株外排泵系統(tǒng)表達量上升,外膜蛋白