2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  接觸腦脊液神經(jīng)核(cerebrospinal fluid-contacting nucleus,CSF-contactingnucleus),簡稱觸液核,是張勵才等以霍亂毒素B亞單位結(jié)合辣根過氧化酶復(fù)合物(horseradish peroxidase-conjugated toxin subunit B,CB-HRP)作為示蹤劑,通過側(cè)腦室引入,在國際上首次發(fā)現(xiàn)并命名的腦內(nèi)特殊神經(jīng)核團(tuán)。該神經(jīng)核主要由接觸腦脊液神經(jīng)元(

2、CSF-contacting neurons,CSF-CN)構(gòu)成,胞體位于中腦與腦橋交界處的中腦導(dǎo)水管(Aqueduct,Aq)下段腹側(cè)及第四腦室底上部的灰質(zhì)中,而突起則伸入腦脊液中。既往的研究證實(shí),觸液核內(nèi)的觸液神經(jīng)元既與腦實(shí)質(zhì)的其他神經(jīng)元和腦血管有形態(tài)學(xué)聯(lián)系,又與腦脊液相接觸。這種特殊的位置關(guān)系,使我們有理由推測,觸液核可能在機(jī)體神經(jīng)-神經(jīng)、腦-腦脊液兩個調(diào)節(jié)通路中均發(fā)揮重要作用。
  脊髓背角既是痛覺中樞傳入的第一級中繼站,

3、也是腦干下行痛覺抑制系統(tǒng)的最終突觸連接點(diǎn),因此脊髓背角成為痛覺調(diào)制通路上極其關(guān)鍵性的作用靶點(diǎn)。目前已知腦干內(nèi)源性下行痛覺抑制系統(tǒng)的主要結(jié)構(gòu)包括中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray,PAG)、中縫核群(raphe nuclei,RN)、藍(lán)斑核(locus coeruleus,LC)以及脊髓背角等。其基本調(diào)控路徑是以PAG為中心,以延腦頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)(rostral ventromedial medulla,RVM)或L

4、C為中繼站,經(jīng)由脊髓背外側(cè)束(dorsolateral funiculus,DLF)下達(dá)至脊髓背角,以脊髓背角膠質(zhì)區(qū)(substantiagelatinosa,SG),即Ⅱ板層為其最終效應(yīng)部位。大量研究表明,參與下行痛覺調(diào)制的主要神經(jīng)活性物質(zhì)為PAG、中縫核群的阿片受體及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),藍(lán)斑核的去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)等,電鏡研究甚至可見PAG及RN的5-羥色胺能

5、神經(jīng)纖維末梢與脊髓背角Ⅱ板層神經(jīng)元有直接的突觸聯(lián)系。
  盡管既往的研究工作表明,觸液核在疼痛調(diào)控中具有重要作用,但這種作用的具體方式、確切路徑及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。鑒于觸液核在解剖位置上與腦干內(nèi)源性下行痛覺抑制系統(tǒng)的PAG和RN互有重疊或毗鄰,且在功能上參與疼痛調(diào)控有關(guān),我們有理由推測,觸液核參與痛覺調(diào)制可能通過腦干內(nèi)源性下行痛覺調(diào)制系統(tǒng)擬或直接與脊髓背角的聯(lián)系而實(shí)現(xiàn)。為證明上述假設(shè),本研究將做如下探討:1.靶向毀損觸液核,觀測缺

6、失觸液核對正常動物和不同疼痛模型動物痛行為的影響;2.進(jìn)一步明確觸液核中與痛相關(guān)物質(zhì)5-HT及阿片受體的分布;3.為觸液核參與下行痛覺抑制調(diào)控提供明確的形態(tài)與物質(zhì)證據(jù)。
  材料與方法:
  一、靶向毀損觸液核對不同疼痛模型痛行為的影響
 ?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)動物
  成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重250-300 g,清潔級,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:蘇SYXK2002-0038)。

7、
 ?。ǘ?shí)驗(yàn)分組
  免疫熒光染色分組:CB組(側(cè)腦室注射霍亂毒素B亞單位結(jié)合辣根過氧化酶復(fù)合物[horseradish peroxidase-conjugated toxin subunit B,CB-HRP]),CB-SAP3d組(側(cè)腦室注射霍亂毒素B亞單位結(jié)合皂草素[horseradish peroxidase-conjugatedsaporin,CB-SAP]3 days),CB-SAP5d組(側(cè)腦室注射CB-S

8、AP5 days),CB-SAP7d組(側(cè)腦室注射CB-SAP7 days),CB-SAP14 d組(側(cè)腦室注射CB-SAP14 days),CB/SAP組(側(cè)腦室注射霍亂毒素B亞單位與皂草素混合物[horseradishperoxidase-unconjugated saporin, CB and SAP] CB和SAP)(n=3)。
  行為學(xué)檢測分組:Control組(n=34),CB-SAP組(側(cè)腦室注射側(cè)腦室注射霍亂毒素

9、B亞單位結(jié)合皂草素,horseradish peroxidase-conjugated saporin,CB-SAP)(n=26),CB/SAP組(側(cè)腦室注射霍亂毒素B亞單位與皂草素混合物[horseradishperoxidase-unconjugated saporin,CB and SAP] CB和SAP)(n=26),其中每組10只用于基礎(chǔ)生理參數(shù)監(jiān)測,8只用于福爾馬林(Formalin)實(shí)驗(yàn),Control組另外16只以及CB

10、-SAP組和CB/SAP組另外各8只用于術(shù)后切口痛實(shí)驗(yàn)。
  (三)側(cè)腦室注射靶向毀損劑、逆行示蹤標(biāo)記觸液核
  大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀。立體定位(Bregma:1.2±0.4 mm,Depth:3.2±0.4 mm,Right to median sagittal plane:1.4±0.2 mm),側(cè)腦室注射上述各分組藥物各3μl,動物靜養(yǎng),灌注、固定、取材,免疫熒光染色技

11、術(shù)標(biāo)記觸液核。
  (四)脊髓背角Fos蛋白表達(dá)檢測
  大鼠麻醉后灌注、固定,取腰段脊髓L4-6節(jié)段,常規(guī)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測脊髓背角Fos蛋白表達(dá)。
 ?。ㄎ澹└栺R林實(shí)驗(yàn)
  將20×20×30 cm不透明有機(jī)玻璃盒置于玻璃板上,玻璃板高于試驗(yàn)臺75cm,為便于觀察大鼠足部活動,玻璃板下放置一面傾斜45。的鏡子。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均放置于有機(jī)玻璃盒中預(yù)適應(yīng)30 min,取出大鼠使用微量注射針于右足底皮下注射

12、5% Formalin溶液20μl,立刻放入有機(jī)玻璃盒中,觀察并記錄大鼠每5 min的舔足時間,連續(xù)觀察記錄1h。實(shí)驗(yàn)過程保持環(huán)境溫度恒定,安靜,整個實(shí)驗(yàn)由固定人員觀察。
 ?。┳愕浊锌谕茨P?br>  大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后,置于超凈臺內(nèi),碘伏消毒右后爪跖部,鋪無菌洞單,參照文獻(xiàn)介紹的方法制備切口痛模型:使用手術(shù)刀片從足底近端0.5 cm處向足趾方向縱行切開1 cm的條形切口,切開足底皮膚后,用

13、眼科鑷提起足底肌肉并縱向鈍性分離,保持其起止附著點(diǎn)完整。切口處紗布壓迫止血,使用5-0尼龍絲線行褥式縫合共2針,手術(shù)整個過程持續(xù)約5 min,術(shù)后肌注3萬IU青霉素預(yù)防感染。
  (七)基礎(chǔ)生理參數(shù)采集及痛行為檢測
  大鼠智能生命體征監(jiān)測儀記錄呼吸頻率(respiratory rate,RR)和心率(heartrate,HR);使用電子體溫計測量大鼠肛溫(body temperature,T);使用大鼠自發(fā)活動視頻追蹤系統(tǒng)

14、記錄分析大鼠自發(fā)活動行為(Locomotor activity)。
  (八)統(tǒng)計學(xué)處理
  所有計量資料均用mean±SEM表示。多組之間比較采用one-way ANOVA或two-way ANOVA(ANOVA with repeated measures),多組之間兩兩比較采用Tukeypost hoc檢驗(yàn);所有數(shù)據(jù)均采用Graph PAD Prism5.0處理并生成統(tǒng)計圖,α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

15、。
  二、與痛相關(guān)物質(zhì)5-HT及阿片受體在觸液核的分布
  (一)實(shí)驗(yàn)動物
  同前。
 ?。ǘ?shí)驗(yàn)分組
  免疫熒光雙標(biāo)染色分為3組:CB/NeuN組,CB/MOR組和CB/5-HT組(n=3)。
 ?。ㄈ┟庖邿晒怆p標(biāo)技術(shù)
  大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后固定至大鼠腦立體定位儀。立體定位(Bregma:1.2±0.4 mm,Depth:3.2±0.4 mm,Right

16、 to median sagittal plane:1.4±0.2 mm),側(cè)腦室注射CB-HRP3μl,動物靜養(yǎng)48 h后灌注、固定、取材,常規(guī)免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)標(biāo)記觸液核與NeuN、MOR或5-HT。
  三、觸液核參與下行痛覺抑制的形態(tài)與物質(zhì)證據(jù)
 ?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)動物
  同前。
 ?。ǘ?shí)驗(yàn)分組
  實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為:CB-HRP組(n=9)和CB-SAP組(n=15),其中每組各3只大鼠用于免疫

17、熒光染色分析,CB-HRP組6只和CB-SAP組12只用于痛行為檢測。
  (三)側(cè)腦室注射靶向毀損劑、逆行示蹤標(biāo)記觸液核
  同前。
 ?。ㄋ模┘顾璞辰荈os蛋白表達(dá)檢測
  同前。
 ?。ㄎ澹┘顾枳⑸淠嫘惺聚檮?br>  大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后,后背部剃毛,暴露腰椎,打開L3椎板暴露L4-L5水平脊髓膨大部位,脊髓內(nèi)注射逆行示蹤劑RedretrobeadsTM(Ⅸ),注射六

18、個位點(diǎn),每個位點(diǎn)注射0.15 ul。
 ?。┯|液核核團(tuán)內(nèi)注射
  2%異氟烷持續(xù)吸入麻醉后,參照Paxinos和Warson《大鼠腦立體坐標(biāo)圖譜》坐標(biāo):(Bregma:-8.2±0.2 mm,Depth:7.0±0.4 mm,Right to median sagittal plane:0.2±0.1 mm),每只大鼠觸液核注射鹽酸嗎啡注射液(300 ng/3ul),停止吸入麻醉后檢測痛行為。
  (七)痛行為檢測

19、
  同前。
 ?。ò耍┐笫笄蕛?nèi)注射
  大鼠吸入2%異氟醚短暫麻醉,后背部剃毛,拱起后背增大棘突間隙。使用帶28號針頭的50μl微量注射器以與脊柱呈45°向頭側(cè)刺入腰椎L2-L3間隙(相當(dāng)于脊髓L4-L5膨大部位)。大鼠突然甩尾或后足抽動表明進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。經(jīng)1 min緩慢注入5-HT(80μg/20μl)后留針15s。
 ?。ň牛┙y(tǒng)計學(xué)處理
  所有計量資料均用mean±SEM表示。兩組之間比較采用un

20、paired Student'st-test;多組之間比較采用one-way ANOVA或two-way ANOVA(ANOVA withrepeated measures),多組之間兩兩比較采用Tukey post hoc檢驗(yàn);所有數(shù)據(jù)均采用Graph PAD Prism5.0處理并生成統(tǒng)計圖,α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  一、靶向毀損觸液核對不同疼痛模型痛行為的影響
 ?。ㄒ唬?/p>

21、側(cè)腦室引入CB-SAP靶向毀損觸液核效果觀察
  與CB-HRP相比,側(cè)腦室引入CB-SAP后3-5天,中腦與腦橋交界處的Aq下段腹側(cè)區(qū)以及第四腦室底上部的灰質(zhì)中可見典型分布的CB免疫反應(yīng)陽性、呈“Y”狀觸液核細(xì)胞群,但其細(xì)胞固縮呈三角形或菱形,伴隨細(xì)胞數(shù)目的減少;側(cè)腦室引入CB-SAP后7-14天,觸液核分布區(qū)CB免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞完全消失,偶可見少量殘留的CB免疫反應(yīng)陽性纖維條索。側(cè)腦室引入CB/SAP后14天,中腦與腦橋交界處

22、的Aq下段腹側(cè)區(qū)以及第四腦室底上部的灰質(zhì)中可見典型分布的觸液核細(xì)胞群。
  (二)靶向毀損觸液核對大鼠基礎(chǔ)生理參數(shù)的影響
  與Control組比較,側(cè)腦室引入CB-SAP或CB/SAP后,大鼠基礎(chǔ)生理指標(biāo)RR、HR、T和自主活動無明顯變化(P>0.05);側(cè)腦室引入CB-SAP后5-14天,大鼠基礎(chǔ)痛閾P(yáng)WL和MWT明顯減低,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.001);而側(cè)腦室引入CB/SAP,大鼠基礎(chǔ)痛閾P(yáng)

23、WL和MWT無明顯變化(P>0.05)。
  (三)靶向毀損觸液核對大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)的影響
  Control組大鼠脊髓背角Fos蛋白少量表達(dá);與Control組比較,CB/SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05);而CB-SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)增加(P<0.001)。
  (四)靶向毀損觸液核對不同疼痛模型痛行為的影響
  足底注射5% formalin后,可以觀察到3

24、組大鼠均出現(xiàn)典型的雙相自發(fā)性痛行為反應(yīng),表現(xiàn)為自發(fā)性舔足或縮足:Ⅰ相(0-10 min)和Ⅱ相(15-50 min)。Control組和CB/SAP組大鼠表現(xiàn)出相似程度的自發(fā)性疼痛行為反應(yīng),兩組比較Ⅰ相和Ⅱ相累積舔足時間無明顯差異(P>0.05)。與CB/SAP組比較,CB-SAP組大鼠自發(fā)性疼痛行為反應(yīng)在Ⅰ相沒有明顯變化,在Ⅱ相明顯增加(P<0.05,P<0.01或P<0.001),且Ⅱ相累積舔足時間明顯增加(P<0.001)。

25、>  與Control組比較,PI組大鼠足底切口術(shù)后出現(xiàn)熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺異常,表現(xiàn)為PWL和MWT時間依賴性降低(P<0.001);與PI組比較,CB/SAP組大鼠疼痛行為程度無明顯差異(P>0.05);與CB/SAP組比較,CB-SAP組大鼠側(cè)腦室引入CB-SAP后12天,PWL和MWT明顯減低(P<0.001),且足底切口術(shù)后,大鼠痛行為反應(yīng)程度加重,表現(xiàn)為PWL和MWT進(jìn)一步降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。

26、
 ?。ㄎ澹┌邢驓p觸液核對不同疼痛模型痛行為的影響
  Formalin組大鼠脊髓背角Fos蛋白大量表達(dá);與Formalin組比較,F(xiàn)ormalin+CB/SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05);而Formalin+CB-SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)增加(P<0.01)(圖5 Ad)。
  Control組大鼠脊髓背角Fos蛋白少量表達(dá);與Control組比較,PI組大鼠脊髓背角Fos蛋白

27、表達(dá)明顯增加(P<0.05);與PI組比較,PI+CB/SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05);而PI+ CB-SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。
  二、與痛相關(guān)物質(zhì)5-HT及阿片受體在觸液核的分布
  側(cè)腦室引入CB-HRP后48小時,免疫熒光顯示大鼠中腦導(dǎo)水管下段腹側(cè)及第四腦室底上部的灰質(zhì)中可見典型的紅色熒光標(biāo)記的CB免疫反應(yīng)陽性、呈“Y”狀分布觸液核細(xì)胞群,其細(xì)胞呈圓形或橢

28、圓形;綠色熒光標(biāo)記的、呈NeuN、MOR或5-HT免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞也分布于該區(qū),且所有CB免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞與NeuN、MOR或5-HT雙標(biāo)。
  三、觸液核參與下行痛覺抑制的形態(tài)與物質(zhì)證據(jù)
 ?。ㄒ唬┯|液核參與下行痛覺抑制的形態(tài)證據(jù)
  側(cè)腦室引入CB-HRP后12天,免疫熒光染色顯示,大鼠腰骶段脊髓背角淺層可見熒光標(biāo)記的呈條索狀或曲張體樣分布的神經(jīng)纖維末梢:紅色熒光標(biāo)記的、呈CB免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)纖維末梢,以及大量

29、綠色熒光標(biāo)記的、呈5-HT免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)纖維末梢;且所有CB免疫反應(yīng)陽性纖維末梢均與5-HT雙標(biāo)。
  脊髓內(nèi)注射逆行示蹤劑Red retrobeadsTM(Ⅸ)后5天,側(cè)腦室引入CB-FITC(直接標(biāo)記觸液核),觸液核分布區(qū)可見綠色熒光標(biāo)記的觸液核神經(jīng)元細(xì)胞群,以及紅色熒光逆行標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞群;所有紅色熒光逆行標(biāo)記的神經(jīng)元與大部分綠色熒光標(biāo)記的觸液核神經(jīng)元重合。
 ?。ǘ┯|液核參與下行痛覺抑制的物質(zhì)證據(jù)
  

30、側(cè)腦室引入CB-SAP后12天,免疫熒光染色顯示,觸液核分布區(qū)無紅色熒光標(biāo)記的、呈CB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元以及綠色熒光標(biāo)記的、呈5-HT或MOR免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元;僅在觸液核分布區(qū)周圍可見綠色熒光標(biāo)記的、呈5-HT或MOR免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元。
  側(cè)腦室引入CB-SAP后12天,免疫熒光染色顯示,大鼠腰段脊髓背角淺層綠色熒光標(biāo)記的、呈5-HT免疫反應(yīng)陽性的條索狀或曲張體樣分布的神經(jīng)纖維末梢明顯減少;免疫熒光光密度定量分析顯示,側(cè)

31、腦室引入CB-SAP可使腰骶段脊髓背角淺層5-HT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維密度明顯減少(P<0.01)。
  側(cè)腦室引入CB-SAP后12天,大鼠基礎(chǔ)痛閾P(yáng)WL和MWT明顯降低,觸液核核團(tuán)內(nèi)注射嗎啡(300μg/3μl)不能逆轉(zhuǎn)側(cè)腦室引入CB-SAP引起的痛閾降低;鞘內(nèi)注射5-HT(80μg/20μl)可逆轉(zhuǎn)側(cè)腦室引入CB-SAP引起的痛閾降低(P<0.001)。
  (三)5-HT或嗎啡對缺失觸液核大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)的

32、影響
  CB-SAP組大鼠脊髓背角Fos蛋白大量表達(dá);與CB-SAP組比較,CB-SAP+5-HT組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。CB-HRP+Morphine組大鼠脊髓背角Fos蛋白有少量表達(dá);與CB-HRP+Morphine組比較,CB-SAP+Morphine組大鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。
  結(jié)論:
  1、側(cè)腦室引入CB-SAP可靶向毀損大鼠觸液核,此方法科學(xué)、

33、可靠的建立觸液核缺失模式動物,為研究并闡明觸液核神經(jīng)生物學(xué)功能提供了良好的方法學(xué)和研究工具;靶向毀損觸液核可加重足底福爾馬林注射后引起的自發(fā)性痛行為和足底手術(shù)切口引起的熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺超敏,本研究首次證實(shí)觸液核參與痛覺抑制調(diào)控作用。
  2、本研究首次證實(shí)觸液核是由一類細(xì)胞膜表達(dá)MOR的神經(jīng)元構(gòu)成,該神經(jīng)元胞漿內(nèi)含有5-HT神經(jīng)遞質(zhì),該研究結(jié)果提示觸液核中與痛相關(guān)物質(zhì)MOR和5-HT的分布介導(dǎo)觸液核參與痛覺抑制調(diào)控作用。

34、>  3、本研究首次發(fā)現(xiàn)觸液核5-HT能神經(jīng)元發(fā)出下行投射纖維,其末梢終止于脊髓背角,該研究結(jié)果為觸液核參與下行痛覺抑制調(diào)控提供了直接的形態(tài)學(xué)依據(jù)。靶向毀損觸液核后,觸液核下行5-HT能神經(jīng)纖維投射通路破壞;觸液核核團(tuán)內(nèi)注射嗎啡不能逆轉(zhuǎn)靶向毀損觸液核引起的痛閾降低,但鞘內(nèi)注射5-HT可逆轉(zhuǎn)靶向毀損觸液核引起的痛閾降低,表明5-HT是觸液核參與下行痛覺抑制調(diào)控的神經(jīng)活性物質(zhì),觸液核MOR可能通過調(diào)控下行5-HT能神經(jīng)纖維投射通路釋放5-H

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