第一部分 利用磁共振技術(shù)對(duì)移植到心臟內(nèi)的鐵磁性標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行在體示蹤的實(shí)驗(yàn)研究;第二部分 冠狀動(dòng)脈內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的存留、分布、遷移和心肌梗死后SDF-1的表達(dá)及細(xì)胞遷移機(jī)制.pdf

1、細(xì)胞移植是目前缺血性心臟病治療研究的熱點(diǎn)之一。目前大多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)于細(xì)胞移植到體內(nèi)之后的存留、分化、遷移等的研究需要通過病理組織切片進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是尋找一種能夠?qū)σ浦布?xì)胞進(jìn)行在體示蹤的手段，以能夠?qū)σ浦布?xì)胞在體內(nèi)的存留、分布、遷移進(jìn)行在體評(píng)價(jià)。 方法:實(shí)驗(yàn)方法分為體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分，針對(duì)一種全新的細(xì)胞標(biāo)記試劑對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記效率、對(duì)細(xì)胞的生長、分化、遷移的影響以及標(biāo)記后的細(xì)胞直接心肌內(nèi)注射移植和經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射移植后的在體

2、顯影和在體顯影維持時(shí)間進(jìn)行了研究。 體外實(shí)驗(yàn)部分：從中華小型豬髂骨處抽取骨髓，體外培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定。將鐵磁性造影劑和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育培養(yǎng)36-48小時(shí)。使用普魯士藍(lán)染色標(biāo)記后的細(xì)胞評(píng)價(jià)鐵離子標(biāo)記的效率；使用MTT比色實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長能力的影響；使用臺(tái)盼藍(lán)染色檢驗(yàn)標(biāo)記后細(xì)胞的活性；用Costar TransWell24孔培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞對(duì)化學(xué)因子的遷移實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)細(xì)胞標(biāo)記后的遷移能力是否受影響；使用細(xì)胞

3、分化誘導(dǎo)液評(píng)價(jià)細(xì)胞標(biāo)記后的分化能力。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．心肌內(nèi)直接注射移植:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立豬的心肌梗死模型(n=15)，模型建立后10天將鐵離子標(biāo)記的自體骨髓間質(zhì)細(xì)胞(1X10<'7>細(xì)胞/只動(dòng)物)通過心肌內(nèi)直接注射方法移植到梗死或正常心肌組織內(nèi)，分別在細(xì)胞移植后當(dāng)天、1周、2周、3周、4周進(jìn)行常規(guī)心臟磁共振檢查，對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行在體顯像。另外5只動(dòng)物作為對(duì)照組，移植未標(biāo)記的骨髓間質(zhì)細(xì)胞。分別在細(xì)胞移植后不同時(shí)間

4、取才動(dòng)物心臟標(biāo)本，切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色觀察細(xì)胞在心肌內(nèi)的分布和形態(tài)。 2．經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射移植:在這部分實(shí)驗(yàn)中我們采用豬的缺血再灌注模型進(jìn)行研究，將冠狀動(dòng)脈阻斷90分鐘后開放，通過導(dǎo)管將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到梗死相關(guān)的冠狀動(dòng)脈內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組6只，注射鐵離子標(biāo)記的細(xì)胞，對(duì)照組3只注射未經(jīng)標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。分別在細(xì)胞移植后當(dāng)天、1周、3周進(jìn)行磁共振檢查和病理組織取材。在組織取材時(shí)同時(shí)取肺臟、肝臟、脾臟、腎臟組織進(jìn)行切片，觀察細(xì)

5、胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射移植后在全身非靶器官的分布情況。 結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)部分： 鐵離子轉(zhuǎn)染后，骨髓間質(zhì)細(xì)胞普魯士藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)有藍(lán)色顆粒存在，細(xì)胞染色陽性率為95％以上；MTT實(shí)驗(yàn)表明不同濃度的鐵磁性標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞增殖沒有明顯的影響；臺(tái)盼藍(lán)染色顯示標(biāo)記后98％的細(xì)胞拒染臺(tái)盼藍(lán)；鐵磁性標(biāo)記物對(duì)rhSDF-1和VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力沒有影響；鐵離子標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞的分化能力不受影響。

6、 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．心肌內(nèi)直接注射：鐵離子標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到心肌組織內(nèi)后，注射點(diǎn)均可通過磁共振顯像，表現(xiàn)為明顯的低信號(hào)灶影或信號(hào)缺失影像。動(dòng)態(tài)觀察顯示細(xì)胞顯像可以持續(xù)到移植后4周，信號(hào)影呈動(dòng)態(tài)變化，強(qiáng)度減低，范圍擴(kuò)大。病理學(xué)檢查可以見移植細(xì)胞呈普魯士藍(lán)染色 陽性，并與磁共振影像學(xué)的顯影有很好的一致性。移植后早期細(xì)胞在心肌內(nèi)聚集成“島狀”，在移植后1周存活的細(xì)胞在心肌內(nèi)散在分布，并且按相同的方向排列。普魯士藍(lán)

7、染的顆粒均在存活的細(xì)胞胞漿內(nèi)，未見單獨(dú)存在的普魯士藍(lán)染色顆粒在梗死的心肌組織內(nèi)存在。對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)注射點(diǎn)顯像和普魯士藍(lán)染色陽性細(xì)胞。 2．冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射：鐵離子標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后，可在磁共振檢查中顯影，移植細(xì)胞在相關(guān)心肌組織區(qū)域內(nèi)呈散在的點(diǎn)狀分布，表現(xiàn)為低密度信號(hào)影像，大小不一。病理組織學(xué)檢查中可見胞漿藍(lán)染的細(xì)胞在左心室前壁、室間隔、右心室前壁的心肌組織內(nèi)分布，與磁共振檢查影像有良好的一致性。移植后當(dāng)時(shí)細(xì)胞較

8、均勻的分布在心肌組織內(nèi)，1周后細(xì)胞散在分布。在移植1周后的肺臟、脾臟、腎臟內(nèi)均可見大量的細(xì)胞存在，肝臟組織內(nèi)少見移植細(xì)胞分布。結(jié)論：這種臨床應(yīng)用的超順磁性氧化鐵微顆粒磁共振造影劑，可以有效地標(biāo)記骨髓間質(zhì)細(xì)胞，不影響細(xì)胞形態(tài)、生長、增殖、分化，不影響細(xì)胞對(duì)化學(xué)趨化因子的遷移能力。利用心臟磁共振技術(shù)可以對(duì)心肌內(nèi)注射的以及冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射的鐵離子標(biāo)記的移植細(xì)胞進(jìn)行在體示蹤。鐵離子標(biāo)記方法結(jié)合磁共振技術(shù)為移植細(xì)胞的在體示蹤和觀察細(xì)胞的存留、遷移提