卵巢特異性轉(zhuǎn)錄因子NOBOX、NANOS3、LHX8在卵巢早衰發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一章轉(zhuǎn)錄因子NOBOX敲除小鼠新生卵巢芯片結(jié)果分析 目的：Nobox是生殖細胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有同源盒結(jié)構域，Nobox基因敲除雌鼠表現(xiàn)為初級卵泡發(fā)育障礙，出生后14天卵巢被纖維組織填充，導致不孕。Nobox作為同源盒蛋白家族成員，通過DNA-同源盒結(jié)構域相互作用調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達，在卵子早期發(fā)生過程發(fā)揮重要作用。研究目的是確定Nobox調(diào)控的下游基因，探討．Nobox對其他卵巢優(yōu)勢表達基因在分子水平的調(diào)節(jié)。

2、 方法：通過基因芯片和實時定量PCR技術，分析Nobox基因敲除新生小鼠卵巢中基因的異常表達。 結(jié)果：基因芯片結(jié)果顯示，Nobox敲除新生小鼠卵巢組織中，29個卵子優(yōu)勢表達基因表達水平較野生型降調(diào)≥5倍；5個卵子優(yōu)勢表達基因表達量升高5倍以上。以Oct4、Rspo2、Nalp4c、Jagl、Sall4、Stra8、Dmrtl、Tekt2、1700019D03Rik和Lin28作為候選基因，利用實時定量PCR技術驗證基因芯片結(jié)果，

3、候選基因在兩種分析系統(tǒng)中表達變化趨勢一致。 結(jié)論：敲除Nobox基因會不同程度的改變卵巢特異性基因的表達，Nobox是調(diào)節(jié)卵子發(fā)生的主導轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。通過對Nobox調(diào)控基因的研究將有助于我們充分認識生殖系統(tǒng)的基因表達調(diào)控及卵子發(fā)生異常疾病的發(fā)病機制。 第二章NOBOX基因突變與卵巢早衰的相關性研究 目的：同源盒基因NOBOX在卵子中特異性表達，在卵泡早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用，是非綜合型卵巢早衰的候選基因之一。

4、本研究目的是探討NOBOX基因突變與卵巢早衰發(fā)病機制的相關性。 方法：以就診于Baylor College of Medicine的96名高加索卵巢早衰患者為研究對象，同時采集278例健康、卵巢功能正常的生育期女性外周血做為正常對照。利用直接測序法篩查卵巢早衰患者NOBOX基因突變情況，并利用凝膠遷移滯后實驗探討錯義突變對DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合功能的影響。 結(jié)果：直接測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個已知的單核苷酸多態(tài)和4個新發(fā)突變。新發(fā)突變

5、包括2個單核苷酸多態(tài)、1同義突變和1個錯義突變；其中p．Arg355His和p．Arg360Gln均發(fā)生在高度保守的同源盒結(jié)構域內(nèi)。凝膠遷移滯后實驗證實p.Arg355His突變蛋白結(jié)合DNA的能力明顯降低，同時對野生型蛋白功能具有顯性負效應。 結(jié)論：NOBX基因突變是一部分卵巢早衰患者的致病原因。 第三章 NANOS3、LHX8基因突變在卵巢早衰發(fā)病機制中的作用 研究第一部分NANOS3基因突變與卵巢早衰的相關

6、性研究 目的：作為最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的母源性基因，Nanos3具有編碼RNA結(jié)合蛋白的功能，在生殖細胞向性象遷移分化的過程中起重要作用。Nanos3基因敲除小鼠表現(xiàn)為卵巢萎縮、各級卵泡缺乏及不孕。人NANOS3因在生殖細胞中特異性表達，并與小鼠Nanos3具有高度同源性.提示NANOS3可能是卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)的候選基因。本研究通過對168例POF患者進行MANOS3基因突變篩查，

7、以探討NANOS3與POF病因的相關性。 方法：應用變性高效液相色譜分析(denaturing high-performance liquidchromatography，DHPLC)(WAVE System 3500 Transgenomic Ltd，Omaha，NE)對80例中國漢族及88例美國高加索人種POF患者NANOS3基因的兩個外顯子進行突變篩查，對DHPLC圖形異常的PCR擴增產(chǎn)物則直接行DNA測序分析(ABI P

8、RISM 310 AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City,CA)。 結(jié)果：結(jié)果顯示66例POF患者DHPLC圖形出現(xiàn)雙峰或?qū)ΨQ性改變(漢族45例、高加索人種21例)，提示存在DNA序列變異。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序分析發(fā)現(xiàn)第一外顯子356位點發(fā)生堿基替換(c.356A>G)，檢索NCBI SNPs Database證實為已知同義單核苷酸多態(tài)(rs2016163)。其中雜合子、純合子在漢族及高加索人種POF組發(fā)

9、生頻率分別為42.5﹪、13.7﹪和14.8﹪、9.1﹪。NANOS3其他編碼序列區(qū)未發(fā)現(xiàn)致病突變。 結(jié)論：本研究沒有在中國漢族和美國高加索人種卵巢早衰患者中發(fā)現(xiàn)NANOS3致病突變，因此推測在中國漢族和美國高加索人群中NANOS3基因突變與卵巢早衰沒有明顯的關系。 第二部分 95例高加索卵巢早衰婦女LHX8突變分析研究 目的：LHX8(LIM homeobox 8)是一種在生殖細胞中特異性表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具

10、有富含半胱氨酸一組氨酸的LIM結(jié)構域，在哺乳動物卵子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過篩查LHX8基因在95例高加索卵巢早衰患者中的突變情況，以探討LHX8在人類卵巢早衰發(fā)病機制中作用。 方法：以95名就診于Baylor college of medicine的美國高加索人種卵巢早衰患者為研究對象，同時收集94名卵巢功能正常的育齡期高加索女性外周血做為對照組，對L,HX8編碼序列進行直接測序分析。 結(jié)果：在內(nèi)含子3和3’