豬卵巢組織差異表達(dá)基因的篩選及相關(guān)基因EGR4、Lhx8和NOBOX的特性研究.pdf

1、豬繁殖性狀一直是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點和難點。我國的太湖豬是世界產(chǎn)仔數(shù)最多的豬種，為了闡明太湖豬的高繁殖性能機制，本研究采用基因芯片技術(shù)對二花臉和皮特蘭豬卵巢組織進行mRNA表達(dá)譜分析，篩選與繁殖性能相關(guān)的差異表達(dá)基因，利用實時熒光定量PCR對關(guān)鍵差異基因進行了驗證。選取差異表達(dá)基因EGR4作為進一步研究的對象，通過RACE方法克隆了該基因的序列，并以各種生物信息學(xué)軟件對序列進行了相關(guān)預(yù)測分析;利用半定量PCR方法分析了EGR4基因在豬各

2、種組織中的表達(dá)譜;以實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)方法對EGR4基因在不同生長時期的卵巢組織、不同發(fā)育時期的卵泡組織做了表達(dá)分析和豬卵巢組織中的定位分析;以豬卵泡顆粒細(xì)胞為實驗材料，用RNAi方法敲減EGR4，利用流式細(xì)胞術(shù)、real-time RT-PCR、Western blot等方法檢測阻抑該基因?qū)ωi卵泡顆粒細(xì)胞的作用及其分子機制。此外，對生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子NOBOX和Lhx8的研究做了進一步的補充，采用實時熒光定量PCR方

3、法分析了NOBOX和Lhx8基因在不同生長時期的卵巢組織、不同發(fā)育時期的卵泡組織的表達(dá)特點;利用熒光素酶的活性分析，研究了NOBOX的核心啟動子，以及Lhx8蛋白對NOBOX的啟動子活性的影響。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.為了研究太湖豬的高繁殖性能機制，采用基因芯片技術(shù)篩選二花臉和皮特蘭豬卵巢組織中的差異表達(dá)基因。結(jié)果表明:在二花臉與皮特蘭豬卵巢組織中篩選到差異基因有1060個，其中上調(diào)基因有487個，下調(diào)基因

4、有573個。對差異表達(dá)基因GO分析發(fā)現(xiàn)379、211、84個差異基因分別獲得生物過程、細(xì)胞組分及分子功能的分類注釋，其余為功能未知基因。通過KEGG pathway分析有120個基因參與50個基因通路，如MAPK信號通路、凋亡通路等。同時，熒光定量PCR驗證了關(guān)鍵基因在兩個豬種的卵巢組織中的表達(dá)，差異趨勢同芯片結(jié)果一致。
　　 2.用電子克隆和RACE方法克隆了豬EGR4基因的cDNA序列，并做預(yù)測分析，結(jié)果表明:豬EGR4基因

5、有兩個剪接體，序列長度分別為2484bp和2226bp。借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源與軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn):豬EGR4基因5'UTR的長度為166bp，3'UTR為533bp，剪接體1的開放閱讀框為1770bp，編碼589個氨基酸，剪接體2的開放閱讀框為1512bp，編碼503個氨基酸;EGR4基因包括2個外顯子和1個內(nèi)含子，和其它哺乳動物的結(jié)構(gòu)一樣;編碼的蛋白質(zhì)沒有疏水區(qū)，不是分泌性蛋白，且未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)，定位于細(xì)胞核，含有三個鋅指結(jié)構(gòu)域，是一種轉(zhuǎn)錄

6、因子，具有DNA結(jié)合活性，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 3.用半定量PCR、real-time RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測EGR4的表達(dá)特點，結(jié)果表明:EGR4基因在豬大腦、小腦、下丘腦、垂體和卵巢組織中大量表達(dá)，輸卵管中微弱表達(dá)，而在其它組織中不表達(dá);總EGR4和剪接體1的表達(dá)趨勢相似，中卵泡中的表達(dá)量顯著高于小卵泡。EGR4在豬卵巢組織中的各個卵泡階段均有表達(dá)，在原始和初級卵泡中，EGR4主要在卵母細(xì)胞中表達(dá)，而顆粒細(xì)胞

7、中只有微弱表達(dá);腔前卵泡中，EGR4在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)加強;有腔卵泡中，EGR4依舊定位在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，此時卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中也有表達(dá)。隨著卵泡的發(fā)育EGR4所起的作用越來越廣泛，說明在豬卵泡發(fā)育、卵泡選擇和排卵過程中起重要作用。
　　 4.為了研究EGR4基因在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的作用，本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細(xì)胞(pGCs)進行體外培養(yǎng)，采用RNAi技術(shù)“沉默”豬EGR4基因，檢測阻抑該基因?qū)ωi卵泡顆粒細(xì)

8、胞生長和相關(guān)細(xì)胞因子的影響。結(jié)果表明:RNA干擾EGR4后，其mRNA和蛋白水平均下調(diào)，即成功“敲減”豬顆粒細(xì)胞中的EGR4基因。阻抑該基因?qū)︻w粒細(xì)胞的凋亡沒有影響，但Bax的表達(dá)上調(diào)， Bcl-2的表達(dá)不受影響。阻抑該基因后，參與雌二醇和孕酮合成關(guān)鍵酶P450arom的表達(dá)量上調(diào)，而P450scc的表達(dá)不變。此外阻抑EGR4基因后，EGR1和EGR3的mRNA水平出現(xiàn)了顯著的下降，EGR2的mRNA水平不變。
　　 5.利用r

9、eal-time RT-PCR方法檢測生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子NOBOX和Lhx8的表達(dá)特點，結(jié)果表明:NOBOX和Lhx8基因均在出生2d的豬卵巢組織中表達(dá)量最高，在25d、75d中呈急劇下降趨勢;在豬卵巢組織中不同發(fā)育時期的卵泡中，NOBOX和Lhx8在中、大卵泡中的表達(dá)量高于小卵泡。結(jié)果說明NOBOX和Lhx8在個體發(fā)育初期，卵泡發(fā)育過程中起著重要作用。
　　 6.利用在線軟件預(yù)測分析豬NOBOX基因上游2300bp序列，結(jié)

10、果發(fā)現(xiàn)該序列有5個潛在的核心啟動子區(qū)域，分別位于+3～-47bp，-90～-140bp，-240～-290bp，-248～-298bp和-732～-782bp，在-350～-498bp處有一個CpG島，將上游1000bp長的序列進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析，有93個位點，暗示這些序列在NOBOX基因的表達(dá)中可能作為順式作用元件發(fā)揮調(diào)控作用。熒光素酶的活性分析發(fā)現(xiàn):在豬腎細(xì)胞中，NOBOX的缺失啟動子NP3(-495～+183)的活性最高，N