池州市雞傳染性喉氣管炎病毒的分離鑒定及gD基因序列分析.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是由雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV）引起的雞病毒性呼吸道疾病，可引起雞死亡或產(chǎn)蛋下降而造成嚴重的經(jīng)濟損失。2015年安徽省池州某雞場120日齡蛋雞發(fā)生疑似雞傳染性喉氣管炎，該場存欄5000只，臨床癥狀為呼吸困難，發(fā)病率為60％，死亡率為60％，為了對該場發(fā)病情況進行確診，本研究采集病雞

2、喉頭氣管組織及其分泌物，剪碎加入3倍體積無菌0.2M PBS充分研磨，反復(fù)凍融三次后離心取上清加入青-鏈霉素(500U/mL)4℃孵育過夜，置于-80℃冰箱備用。提取病雞喉頭氣管及其分泌物總DNA并根據(jù)GenBank發(fā)表的雞傳染性喉氣管炎病毒gD基因設(shè)計合成一對特異性引物，從發(fā)病雞喉頭及其分泌物中擴增出1134bp大小片段;制備的組織液上清經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)途徑接種10日齡SPF

3、雞胚，120h后打開雞胚，發(fā)現(xiàn)在雞胚CAM上發(fā)現(xiàn)典型痘斑，收集病變雞胚痘斑和尿囊液，充分研磨，反復(fù)凍融并離心取上清按照相同途徑連續(xù)接種雞胚三次，取第4代雞胚分離毒作為種毒，保存于-80℃;將種毒通過滴鼻、點眼的方式接種5日齡健康麻羽肉雞，每只102EID50作為試驗組，并使用同等劑量的無菌PBS設(shè)置陰性對照，連續(xù)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn):攻毒3d后試驗組出現(xiàn)采食量下降，呼吸困難，眼結(jié)膜壞死等癥狀，第4～5d癥狀加重并出現(xiàn)兩只雛雞死亡，第9d開始預(yù)

4、后;而同時對照組無任何癥狀;剖檢病死雞發(fā)現(xiàn)其喉頭氣管出血，盲腸扁桃體腫大，并可從病死雞喉頭氣管及其分泌物中檢測到病毒。結(jié)果證實分離到一株雞傳染性喉氣管炎病毒，命名為CZ-ILTV16株。以第4代雞胚分離毒為材料提取病毒DNA，并擴增gD基因，膠回收純化后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆鑒定正確后進行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GenBank上已發(fā)表gD基因序列同源性在99％以上，基因進化樹分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離毒處于獨立分