Cbl-b調(diào)節(jié)C225誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　胃癌是世界范圍內(nèi)最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，在亞洲國(guó)家是腫瘤死亡的主要原因。多數(shù)患者在診斷時(shí)已經(jīng)是進(jìn)展期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率只有10％-15％。化療是治療晚期胃癌的主要手段。盡管化療藥物的應(yīng)用使晚期病人的生存期有所延長(zhǎng)，但中位總生存時(shí)間很難超過(guò)12個(gè)月。近年來(lái)興起的靶向治療使個(gè)體化治療成為可能，明顯提高了腫瘤治療的療效。靶向治療是建立在對(duì)基因、受體認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的治療領(lǐng)域，具有十分廣闊的前景。其中針對(duì)表皮生長(zhǎng)因

2、子受體(epidermal growth factor receptor EGFR)的治療成為目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。
　　表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族是跨膜的受體型酪氨酸激酶中最具有代表性的分子之一。據(jù)有廣泛的生物學(xué)功能，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的過(guò)程中具有重要作用。研究表明，在乳腺癌、大腸癌、肺癌、頭頸部鱗癌等多種上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤中存在EGFR基因的異常活化、擴(kuò)增以及過(guò)度表達(dá)。Cetuximab(C225)是EGFR的

3、單克隆抗體，在結(jié)直腸癌，非小細(xì)胞肺癌及頭頸部腫瘤中與化療聯(lián)合取得了很好的療效。因此，研究C225對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制可為胃癌的治療提供理論依據(jù)。
　　磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-re

4、gulated protein kinase，ERK）在維持細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但PI3K/Akt和MAPK/ERK通路在C225抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　Cbl家族蛋白（Cb-b和c-Cbl）是一種高度保守的RING家族E3泛素連接酶，在生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。研究表明它能通過(guò)特異性地選擇底物蛋白啟動(dòng)泛素化降解途徑而

5、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明E3泛素連接酶Cbl-b(Casitas B lineage lymphoma-b)在誘導(dǎo)T細(xì)胞CD3的細(xì)胞凋亡中起重要作用，但關(guān)于Cbl蛋白在C225誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制不清楚。
　　本課題以胃癌細(xì)胞株MGC803，BGC823，SGC7901為模型，初步觀察了C225對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對(duì)PI3K/Akt和MAPK/ERK通路及其上游分子泛素連接酶Cbl家

6、族蛋白在此過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　材料與方法:
　　1.采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，繪制增殖曲線。
　　2.采用流式細(xì)胞儀通過(guò)PI染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡判定。
　　3.采用Western blot檢測(cè)ERK，P-ERK，Akt，P-Akt，Cbl-b蛋白的表達(dá)。
　　4.采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以(x)±s表示，兩組間差異采

7、用Student'st test分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.EGF以時(shí)間依賴性方式促進(jìn)MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞增殖。以0.5ng/mlEGF處理MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞72h，細(xì)胞的增殖比率分別是對(duì)照組的482％，450％，232％。以0.1μg/mlC225作用于EGF預(yù)處理的MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞72h，C225可部分抑制E

8、GF誘導(dǎo)的MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞增殖，抑制率分別為12％，15％，17％。
　　2.流式細(xì)胞儀分析顯示0.1μg/ml的C225誘導(dǎo)不超過(guò)25％的細(xì)胞凋亡。C225作用于胃癌MGC803，BGC823細(xì)胞24h后，分別誘導(dǎo)21.54±2.42％，10.24±3.24％的細(xì)胞凋亡。
　　3.EGF以時(shí)間依賴方式上調(diào)p-ERK的表達(dá)。0.5ng/mlEGF作用于MGC803細(xì)胞24h，p-ERK的表達(dá)水平

9、是對(duì)照組的3.46倍。以0.1ug/mlC225預(yù)處理4h，再0.5ng/mlEGF處理，EGF引起的ERK磷酸化水平降低，提示C225部分抑制了EGF引起MAPK/ERK通路活化。
　　4.EGF以時(shí)間依賴方式上調(diào)p-Akt的表達(dá)。0.5ng/mlEGF作用于MGC803細(xì)胞24h，p-Akt的表達(dá)水平是對(duì)照組的3.12倍。以0.1ug/mlC225預(yù)處理4h，再以0.5ng/mlEGF處理，EGF引起的Akt磷酸化水平降低，提

10、示C225部分抑制了EGF引起的PI3K/Akt通路活化。
　　5.0.5ng/mlEGF作用于MGC803細(xì)胞24h，Western blot結(jié)果顯示Cbl-b表達(dá)水平下調(diào)（是對(duì)照組的0.85倍），0.1ug/mlC225處理24h，Western blot結(jié)果顯示Cbl-b表達(dá)水平明顯上調(diào)（是對(duì)照組的2.78倍）。
　　6.0.1 ug/mlC225作用于MGC803細(xì)胞24h，Western blot結(jié)果顯示，C225

11、能上調(diào)Cbl-b的表達(dá)，進(jìn)一步檢測(cè)Cbl-b的下游分子Akt，發(fā)現(xiàn)p-Akt表達(dá)下調(diào)，且p-Akt表達(dá)的下調(diào)與Cbl-b表達(dá)的上調(diào)同時(shí)發(fā)生。用蛋白酶體通路抑制劑硼替佐米(Ps341)抑制泛素連接酶Cbl的功能，結(jié)果顯示，以10nMPs341預(yù)處理MGC803細(xì)胞4h，再以C225作用于胃癌細(xì)胞MGC803，繼續(xù)培養(yǎng)24h后細(xì)胞凋亡較單純C225組明顯減少，同時(shí)Western blot結(jié)果顯示Ps341部分逆轉(zhuǎn)了C225下調(diào)p-Akt表達(dá)

12、的作用。
　　7.使用Lipo2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型Cbl-b的表達(dá)載體進(jìn)入MGC803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后用Western blot的方法證實(shí)Cbl-b的表達(dá)量提高。與陰性對(duì)照相比，在Cbl-b轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，C225誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡被部分逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　1.C225能抑制EGF作用下胃癌細(xì)胞系MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡。
　　2.C225在促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803凋亡過(guò)程