泛素連接酶Cbl-b抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是全世界發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是亞洲國(guó)家引起腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。多數(shù)患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，5年生存率只有10％-15％。盡管化療、放療及靶向治療的應(yīng)用提高了晚期胃癌患者的生存率，但絕大多數(shù)患者都面臨復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，中位總生存時(shí)間不足12個(gè)月。其原因主要?dú)w結(jié)于胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制不明，且尚無(wú)有效的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，深入探討胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)降低腫瘤復(fù)發(fā)、控制轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)晚期胃癌患者生存時(shí)間至

2、關(guān)重要。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、多步驟的過(guò)程，涉及諸多因子，其機(jī)制極為復(fù)雜。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT是指在某些特殊的生理或病理?xiàng)l件下，具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。研究表明，EMT在包括胃癌在內(nèi)的多種上皮腫瘤的原位浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。據(jù)報(bào)道，胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulin

3、-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)可與上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體IGF-ⅠR結(jié)合，激活下游PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架功能，誘導(dǎo)乳腺癌及前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。此外，胃癌組織中IGF-ⅠR的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且IGF-ⅠR過(guò)表達(dá)是影響晚期胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR通路有可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　EMT的發(fā)生、發(fā)展受

4、多種因素的調(diào)節(jié)，如腫瘤微環(huán)境、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子、泛素化、DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA等。泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過(guò)程，其在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。泛素連接酶Cbl家族是泛素化過(guò)程的關(guān)鍵酶。Cbl蛋白包括3個(gè)同源體，c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶c-Cbl參與了EMT的調(diào)控。Cbl-b和c-Cbl有相似的結(jié)構(gòu)和功能。有研

5、究報(bào)告，Cbl-b參與了IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和EGFR介導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞間粘附連接的破壞。但是Cbl-b是否能調(diào)節(jié)IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR信號(hào)通路，并因此參與IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)以人胃癌細(xì)胞株MGC803、SGC7901和BGC-823為模型，研究IGF-Ⅰ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，同時(shí)對(duì)EMT調(diào)控因子Cbl-b在此過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　材料與方

6、法：
　　1、采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2、采用Transwell法測(cè)定細(xì)胞遷移能力。
　　3、采用Western blot檢測(cè)E-cadherin，Vimentin，ZEB1，ZBE2，Snail，Twist2，IGF-ⅠR，p-IGF-ⅠR，ERK，p-ERK，Akt，p-Akt，Cbl-b和Actin蛋白的表達(dá)。
　　4、采用免疫共沉降技術(shù)檢測(cè)蛋白間的共結(jié)合。
　　5、采用免疫熒光顯微技術(shù)觀察

7、E-cadherin，Vimentin蛋白的分布。
　　6、采用RT-PCR檢測(cè)ZEB2的mRNA表達(dá)水平。
　　7、采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)microRNA-200c的表達(dá)水平。
　　8、采用GeneChip miRNA Array檢測(cè)人類(lèi)microRNA的表達(dá)水平。
　　9、構(gòu)建靶向Cbl-b基因的短發(fā)夾環(huán)RNA(shRNA)真核質(zhì)粒表達(dá)載體，建立Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC-803

8、細(xì)胞系。
　　10、免疫組化染色檢測(cè)胃癌組織標(biāo)本中IGF-ⅠR與Cbl-b的表達(dá)情況。
　　11、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)和Fisher精確計(jì)算概率法，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、IGF-Ⅰ能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT
　　將MGC803、SGC7901和BGC-823細(xì)胞在無(wú)

9、血清的培養(yǎng)液中饑餓過(guò)夜，加入100ng/mL的IGF-Ⅰ處理48小時(shí)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。三種細(xì)胞從島狀的連接緊密的類(lèi)圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)梭形的、連接松散的間質(zhì)細(xì)胞，部分細(xì)胞伸出偽足，排列紊亂。熒光顯微鏡觀察到，IGF-Ⅰ處理組的胃癌細(xì)胞E-cad蛋白自胞膜向胞漿轉(zhuǎn)位，Vimentin蛋白向細(xì)胞一側(cè)或雙側(cè)極化聚集。Western blot檢測(cè)了上皮和間質(zhì)表型標(biāo)志物以及相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IGF-Ⅰ處理后的細(xì)

10、胞E-cadherin(E-cad)顯著降低，Vimentin表達(dá)上調(diào)，核轉(zhuǎn)錄因子ZEB2明顯上調(diào)，而其他轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、Snail和Twist2變化不明顯。同時(shí)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ處理后的胃癌細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，其中MGC-803細(xì)胞，加藥組與對(duì)照組相比，細(xì)胞平均遷移率自26±4.0％升高至78±1.5％; SGC-7901細(xì)胞平均遷移率自36±1.5％升高至79±8.5％(P＜0.05)。結(jié)果提

11、示，IGF-Ⅰ能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移能力。
　　2、IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT部分依賴(lài)于其下游的Akt和ERK信號(hào)通路
　　100 ng/mL IGF-Ⅰ作用MGC803、SGC-7901和BGC-823細(xì)胞3分鐘后，下游的IGF-ⅠR，Akt和ERK瞬時(shí)性活化增強(qiáng)，6小時(shí)后活化水平逐漸恢復(fù)至基線。IGF-ⅠR/ⅠR特異性抑制劑OSI-906(10μM)預(yù)處理2小時(shí)后，加入IGF-Ⅰ作用48小時(shí)，

12、觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測(cè)上皮和間質(zhì)標(biāo)志物水平變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，聯(lián)合應(yīng)用OSI和IGF-Ⅰ處理組的細(xì)胞形態(tài)呈緊密連接的上皮表型;E-cad下調(diào)和Vimentin、ZEB2上調(diào)水平逆轉(zhuǎn)。在聯(lián)合應(yīng)用PI3K/Akt抑制劑LY294002(100μM)和IGF-Ⅰ，或ERK抑制劑PD98059（20μM）和IGF-Ⅰ后，EMT現(xiàn)象和ZEB2表達(dá)水平被部分逆轉(zhuǎn)。同樣，在應(yīng)用siRNA瞬時(shí)敲除Akt或ERK后，IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT以

13、及ZEB2上調(diào)被部分的逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示，IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT部分依賴(lài)于其下游的Akt和ERK信號(hào)通路。
　　3、Akt/ERK-miR-200c-ZEB2信號(hào)軸和Akt-GSK-3β-ZEB2信號(hào)通路可能參與了IGF-Ⅰ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT
　　100 ng/mL IGF-Ⅰ作用MGC803和SGC-7901細(xì)胞48小時(shí)后，核轉(zhuǎn)錄因子ZEB2顯著上調(diào)，而ZEB2的mRNA水平并未發(fā)生改變。Real-time PCR

14、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在IGF-Ⅰ處理MGC803和SGC-7901細(xì)胞發(fā)生EMT后，microRNA-200c(miR-200c)的相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組相比分別降低30％和50％，P＜0.05。此外，在IGF-Ⅰ作用前應(yīng)用Akt抑制劑LY294002(100μM)或ERK抑制劑PD98059(20μM)預(yù)處理，miR-200c表達(dá)水平無(wú)明顯改變。以上結(jié)果提示，在IGF-Ⅰ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT的進(jìn)程中可能存在著由Akt/ERK-miR-200c-ZEB

15、2組成的信號(hào)軸的參與。另外，100ng/mL IGF-Ⅰ處理BGC-823細(xì)胞30分鐘后，GSK-3β的Ser9位點(diǎn)顯著活化，而當(dāng)LY294002(100μM)預(yù)處理BGC-823細(xì)胞2小時(shí)后再加入100 ng/mL IGF-Ⅰ作用30分鐘，GSK-3β的Ser9位點(diǎn)的活化被抑制。結(jié)果提示，PI3K/Akt信號(hào)通路的活化抑制GSK-3β的活性。而應(yīng)用GSK-3β抑制劑AR-A01448(25μM)預(yù)處理2小時(shí)后再加入IGF-Ⅰ處理48小

16、時(shí)，BGC-823細(xì)胞呈較為典型的間質(zhì)化表型，Vimentin和ZEB2上調(diào)程度較對(duì)照組更為顯著。以上結(jié)果提示，在IGF-Ⅰ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT的過(guò)程中存在另一條Akt-GSK-3β-ZEB2通路，GSK-3β發(fā)揮維持胃癌細(xì)胞上皮表型的功能。
　　4、Cbl-b抑制了IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT，維持了上皮細(xì)胞表型
　　為探討泛素連接酶Cbl-b在EMT中的作用，我們構(gòu)建Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC-803細(xì)胞系

17、，G418壓力篩選陽(yáng)性克隆，Western blot驗(yàn)證，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞系作為對(duì)照，選取表達(dá)率為對(duì)照組10％以下的細(xì)胞株為陽(yáng)性細(xì)胞株。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定敲除Cbl-b的胃癌細(xì)胞失去緊密連接的上皮結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)EMT的特征。在IGF-Ⅰ處理后，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)一步向間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)化。同時(shí)，穩(wěn)定敲除Cbl-b(ShRNA Cbl-b)組在加入IGF-Ⅰ處理后，E-cad下調(diào)、Vimentin和ZEB2上調(diào)水平進(jìn)一步增強(qiáng)。Tr

18、answell實(shí)驗(yàn)同樣顯示，穩(wěn)定敲除Cbl-b的ShRNACbl-b細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組增強(qiáng);當(dāng)加入IGF-Ⅰ作用后，ShRNA Cbl-b組的細(xì)胞遷移能力進(jìn)一步增強(qiáng)。上述結(jié)果提示，Cbl-b抑制了IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT，維持了上皮細(xì)胞的表型。
　　5、Cbl-b負(fù)調(diào)控Akt/ERK-miR-200c-ZEB2軸，抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT
　　100 ng/mL IGF-Ⅰ短時(shí)間分別作用于沉默Cbl-b基因的

19、胃癌細(xì)胞(ShRNA Cbl-b)及對(duì)照組細(xì)胞(NS Control)，其下游Akt和ERK信號(hào)通路活化時(shí)間較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)。同時(shí)，基因芯片和Real-Time PCR發(fā)現(xiàn)，ShRNA Cbl-b組細(xì)胞miR-200c的表達(dá)較對(duì)照組相比分別降低50％和70％，P＜0.05。研究提示Cbl-b可能是通過(guò)抑制Akt/ERK-miR-200c-ZEB2軸，從而抑制了IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT。
　　6、Cbl-b通過(guò)泛素化降解IGF

20、-ⅠR，抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT
　　100 ng/mL IGF-Ⅰ作用MGC-803、SGC-7901和BGC-823細(xì)胞48小時(shí)后，IGF-ⅠR表達(dá)顯著降低。為證實(shí)Cbl-b能否通過(guò)泛素化降解IGF-ⅠR，參與EMT的進(jìn)程，MGC-803細(xì)胞首先經(jīng)PS341(5nM)預(yù)處理12小時(shí)后，再用IGF-Ⅰ作用48小時(shí)，IGF-ⅠR的降解水平被明顯抑制。免疫共沉降實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)IGF-Ⅰ作用MGC-803細(xì)胞1小時(shí)后，Cbl-

21、b與IGF-ⅠR共結(jié)合，6小時(shí)IGF-ⅠR發(fā)生泛素化降解，12小時(shí)泛素化降解最為明顯。而與對(duì)照組相比，穩(wěn)定敲除Cbl-b的MGC-803細(xì)胞在IGF-Ⅰ作用后IGF-ⅠR泛素化降解并不明顯。以上結(jié)果提示Cbl-b可能是通過(guò)泛素化降解IGF-ⅠR，抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT。
　　7、胃癌患者組織中Cbl-b與IGF-ⅠR表達(dá)的相關(guān)性及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的分析
　　選擇100例原發(fā)性胃腺癌患者組織標(biāo)本，采用免疫組化方法檢

22、測(cè)Cbl-b與IGF-ⅠR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，100例入組的患者標(biāo)本中，69％的患者IGF-ⅠR呈陽(yáng)性表達(dá)，58％的患者Cbl-b呈陽(yáng)性表達(dá)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明Cbl-b的表達(dá)與IGF-ⅠR的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.265，p＜0.05。二者的表達(dá)率與臨床病理特征的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，IGF-ⅠR的表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例(p＜0.05); Cbl-b的表達(dá)顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例(p＜

23、0.05)。在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期的病例中，IGF-ⅠR的表達(dá)顯著高于Ⅰ-Ⅱ期的病例(p＜0.05);Cbl-b的表達(dá)顯著低于Ⅰ-Ⅱ期的病例(p＜0.05)。而二者的表達(dá)與年齡、性別和Lauren分型無(wú)相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、IGF-Ⅰ能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901和BGC-823細(xì)胞EMT。
　　2、IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT部分依賴(lài)于IGF-ⅠR下游Akt和ERK信號(hào)通路。
　　3、由

24、Akt/ERK-miR-200c-ZEB2組成的信號(hào)軸和Akt-GSK-3β-ZEB2通路參與IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT。
　　4、Cbl-b能夠抑制Akt/ERK-miR-200c-ZEB2軸，負(fù)向調(diào)控IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT。
　　5、Cbl-b能夠泛素化降解IGF-ⅠR，抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的EMT，維持胃癌細(xì)胞的上皮表型。
　　6、Cbl-b與IGF-ⅠR在胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，更多IGF-