實驗性癲癇大鼠認知功能障礙的機制探討及尼莫地平的影響.pdf

1、癲癇是由于腦部興奮性過高的某些神經元突然異常放電引起的腦功能異常,是一種常見的慢性臨床綜合征.本文通過對突觸可塑性及鈣信號轉導的研究,探討癲癇后認知功能障礙的可能發(fā)生機制,并觀察尼莫地平的腦保護作用。 第一部分慢性癲癇大鼠模型的制備、行為學測定及尼莫地平的影響 目的:建立戊四氮點燃慢性癲癇大鼠模型,觀察其學習記憶能力的變化及尼莫地平的影響。 方法:選用健康雄性SD大鼠,經兩次Y-迷宮篩選合格后隨機分四組。NC(n

2、ormal control)組大鼠(35只)每日腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共44 d.PTZ組(40只)每日腹腔注射1％PTZ 35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前15 min腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共14 d.NMD1組(40只)及NMD2組(40只)每日腹腔注射1％PTZ 35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前15 min分別腹腔注射NMD1.25 mg

3、/kg、2.5 mg/kg,共14 d.造模成功后描記腦電圖(electroencephalogram,EEG)變化,并采用Morris水迷宮和Y-迷宮實驗,進行大鼠學習和記憶成績的測試。 結果:大鼠在注射PTZ后第6～10天起開始出現(xiàn)凝視、點頭、反復洗臉動作、面部及頭部抽搐等,以后發(fā)作癥狀逐日加重,于給藥第18～24天出現(xiàn)全身肌陣攣、雙前肢抬起,最終發(fā)生全身強直.陣攣性發(fā)作,達到RacineⅣ～Ⅴ級的點燃標準,以后每天均有Ⅳ～

4、Ⅴ級發(fā)作.第30天時PTZ組大鼠35只完全點燃,NMD1組34只完全點燃,NMD2組35只完全點燃.第31～44天,PTZ組大鼠每天仍有Ⅳ～Ⅴ級癲癇發(fā)作,NMD1和NMD2組大鼠癲癇發(fā)作程度減輕.NC組大鼠自始至終無癲癇發(fā)作表現(xiàn).EEG表現(xiàn):NC組大鼠EEG以α、β波為主,背景正常,無異常放電現(xiàn)象.PTZ組大鼠EEG表現(xiàn)為在基礎波背景下,陣發(fā)性出現(xiàn)大量高幅尖波、棘波、棘慢復合波,持續(xù)1～2s.NMD1組和NMD2組大鼠EEG表現(xiàn)為癇性放

5、電受到抑制,在基礎波背景下可見散在少量棘波或尖波,波幅降低.Morris水迷宮實驗中定位航行實驗結果:每日逃避潛伏期取其平均值進行比較.第1天,四組大鼠的逃避潛伏期比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第2天,與NC組的逃避潛伏期(15.14±4.69.)s比較,PTZ組逃避潛伏期(27.36±6.13)s明顯延長(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期(21.66±5.21)s及(19.76±5.81)s較PTZ組縮短(P<0

6、.05),但與NC組比較明顯延長(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期比較無統(tǒng)計學意義。第3天,PTZ組大鼠的逃避潛伏期(7.71±1.30)s與NC組(4.46±1.11)s比較有顯著性差異(P<0.01)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期(5.94±1.19)s及(5.69±1.03)s仍短于PTZ組(P<0.05),但長于NC組(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05).空

7、間探索試驗結果:PTZ組大鼠120 s內穿越平臺區(qū)域的次數(shù)(5.73±2.14)明顯低于NC組(9.25±2.18)(P<0.01)；NMD1、NMD2組大鼠120 s內穿越平臺區(qū)域的次數(shù)(8.58±2.12)及(7.51±2.05)與PTZ組比較明顯增多(P<0.01),但與NC組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；NMD1組和NMD2組大鼠120 s內穿越平臺區(qū)域的次數(shù)二者比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05).在平臺象限的游泳時間四組比較

8、無顯著性差異(P>0.05).Y迷宮檢測結果:PTZ組大鼠的錯誤反應次數(shù)(error number,EN)(12.75±2.50)與NC組(6.25±3.10)比較明顯增多(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的錯誤反應次數(shù)(8.75±2.22)和(8.00±3.16)與PTZ組比較又明顯減少(P<0.05),但NMD1組和NMD2組與NC組比較無顯著性差異(P>0.05)；NMD1組和NMD2組比較也無顯著性差異(P>0.05).全

9、天總反應時間四組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論:本實驗建立的戊四氮點燃癲癇大鼠模型類似人類慢性癲癇發(fā)作,且具備學習和記憶能力缺損,是研究癲癇后認知功能障礙比較理想的動物模型,尼莫地平可以部分改善慢性癲癇大鼠的學習記憶功能缺損。 第二部分慢性癲癇大鼠海馬突觸后致密物95與突觸素表達的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點燃慢性癲癇大鼠海馬P38及PSD-95表達的變化及尼莫地平的影響,探討P38及PSD

10、-95在癲癇后認知功能障礙中的作用與意義。 方法:每組大鼠各取8只,10％水合氯醛麻醉,4％多聚甲醛灌注固定,取含海馬腦段,石蠟包埋,冠狀切片,采用SP法行PSD-95及P38免疫組化染色,測定免疫反應產物吸光度.每組大鼠各取8只,迅速分離海馬,Trizol提取總RNA,應用反轉錄.聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測定大鼠海馬PSD-95 mRNA表達的變化。 結論:PTZ點燃癲癇大鼠海馬組織P38、PSD-95及PS

11、D-95 mRNA表達水平均降低,并且與大鼠學習和記憶成績下降相一致,提示P38及PSD-95可能參與了癲癇后認知功能障礙的發(fā)病機制；尼莫地平可以提高癲癇大鼠海馬組織P38蛋白、PSD-95蛋白及mRNA表達水平,進而促進癲癇大鼠學習和記憶能力改善。 第三部分慢性癲癇大鼠海馬神經元和突觸超微結構的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點燃慢性癲癇大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構和突觸超微結構(SVD、PSD、WSC)的變化

12、及尼莫地平的干預作用,探討突觸可塑性與癲癇后認知功能障礙的關系。 方法:每組大鼠各取3只,10％水合氯醛麻醉,4％多聚甲醛(含2.5％戊二醛)灌注固定,利用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構和突觸超微結構(SVD、PSD、WSC)的變化。 結論:癲癇大鼠海馬CA1區(qū)存在神經元與突觸超微結構異常,尼莫地平可以改善神經元及突觸超微結構的病理學變化,這些與癲癇大鼠學習和記憶能力的變化相平行,說明突觸可塑性與癲

13、癇后認知功能障礙之間存在密切關系。 第四部分慢性癲癇大鼠海馬[Ca2+]i和鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIα的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點燃慢性癲癇大鼠海馬[Ca2+]i及CaMK IIα,P-CaMK IIα蛋白、CaMK IIα mRNA表達的變化及尼莫地平的干預作用,探討鈣信號轉導與癲癇后認知功能障礙的關系。 方法:每組大鼠各取6只,10％水合氯醛麻醉,迅速取海馬,制備海馬組織混懸液,負載Flu

14、o-3/AM,采用流式細胞分析技術測定各組大鼠海馬細胞[Ca2+]i變化；RT-PCR方法檢測CaMK IIα mRNA表達的變化.每組大鼠各取8只,10％水合氯醛麻醉,迅速取海馬,提取海馬總蛋白及膜蛋白,Western blot方法檢測海馬CaMK IIα,P-CaMK IIα蛋白表達的變化。 結論:戊四氮點燃慢性癲癇大鼠海馬內存在鈣超載及P-CaMK Ⅱa,CaMK Ⅱa蛋白及CaMK Ⅱa mRNA表達水平降低,導致鈣信號

15、轉導異常,可能參與了癲癇后認知功能障礙的發(fā)病機制；尼莫地平可以調節(jié)海馬[Ca2+]i水平,增強P-CaMK Ⅱa,CaMK Ⅱa蛋白及CaMK Ⅱa mRNA表達水平,與它提高癲癇大鼠學習記憶成績相一致,提示尼莫地平具有改善認知功能的藥理學作用。 第五部分慢性癲癇大鼠海馬CREB表達水平的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點燃慢性癲癇大鼠海馬P-CREB蛋白及CREBmRNA表達的變化及尼莫地平的干預作用,探討核轉錄