實(shí)驗(yàn)性癲癇大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制探討及尼莫地平的影響.pdf

1、癲癇是由于腦部興奮性過高的某些神經(jīng)元突然異常放電引起的腦功能異常,是一種常見的慢性臨床綜合征.本文通過對(duì)突觸可塑性及鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究,探討癲癇后認(rèn)知功能障礙的可能發(fā)生機(jī)制,并觀察尼莫地平的腦保護(hù)作用。 第一部分慢性癲癇大鼠模型的制備、行為學(xué)測(cè)定及尼莫地平的影響 目的:建立戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠模型,觀察其學(xué)習(xí)記憶能力的變化及尼莫地平的影響。 方法:選用健康雄性SD大鼠,經(jīng)兩次Y-迷宮篩選合格后隨機(jī)分四組。NC(n

2、ormal control)組大鼠(35只)每日腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共44 d.PTZ組(40只)每日腹腔注射1％PTZ 35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前15 min腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共14 d.NMD1組(40只)及NMD2組(40只)每日腹腔注射1％PTZ 35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前15 min分別腹腔注射NMD1.25 mg

3、/kg、2.5 mg/kg,共14 d.造模成功后描記腦電圖(electroencephalogram,EEG)變化,并采用Morris水迷宮和Y-迷宮實(shí)驗(yàn),進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)和記憶成績的測(cè)試。 結(jié)果:大鼠在注射PTZ后第6～10天起開始出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、反復(fù)洗臉動(dòng)作、面部及頭部抽搐等,以后發(fā)作癥狀逐日加重,于給藥第18～24天出現(xiàn)全身肌陣攣、雙前肢抬起,最終發(fā)生全身強(qiáng)直.陣攣性發(fā)作,達(dá)到RacineⅣ～Ⅴ級(jí)的點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn),以后每天均有Ⅳ～

4、Ⅴ級(jí)發(fā)作.第30天時(shí)PTZ組大鼠35只完全點(diǎn)燃,NMD1組34只完全點(diǎn)燃,NMD2組35只完全點(diǎn)燃.第31～44天,PTZ組大鼠每天仍有Ⅳ～Ⅴ級(jí)癲癇發(fā)作,NMD1和NMD2組大鼠癲癇發(fā)作程度減輕.NC組大鼠自始至終無癲癇發(fā)作表現(xiàn).EEG表現(xiàn):NC組大鼠EEG以α、β波為主,背景正常,無異常放電現(xiàn)象.PTZ組大鼠EEG表現(xiàn)為在基礎(chǔ)波背景下,陣發(fā)性出現(xiàn)大量高幅尖波、棘波、棘慢復(fù)合波,持續(xù)1～2s.NMD1組和NMD2組大鼠EEG表現(xiàn)為癇性放

5、電受到抑制,在基礎(chǔ)波背景下可見散在少量棘波或尖波,波幅降低.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果:每日逃避潛伏期取其平均值進(jìn)行比較.第1天,四組大鼠的逃避潛伏期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第2天,與NC組的逃避潛伏期(15.14±4.69.)s比較,PTZ組逃避潛伏期(27.36±6.13)s明顯延長(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期(21.66±5.21)s及(19.76±5.81)s較PTZ組縮短(P<0

6、.05),但與NC組比較明顯延長(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第3天,PTZ組大鼠的逃避潛伏期(7.71±1.30)s與NC組(4.46±1.11)s比較有顯著性差異(P<0.01)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期(5.94±1.19)s及(5.69±1.03)s仍短于PTZ組(P<0.05),但長于NC組(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的逃避潛伏期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).空

7、間探索試驗(yàn)結(jié)果:PTZ組大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)(5.73±2.14)明顯低于NC組(9.25±2.18)(P<0.01)；NMD1、NMD2組大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)(8.58±2.12)及(7.51±2.05)與PTZ組比較明顯增多(P<0.01),但與NC組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NMD1組和NMD2組大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間四組比較

8、無顯著性差異(P>0.05).Y迷宮檢測(cè)結(jié)果:PTZ組大鼠的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)(error number,EN)(12.75±2.50)與NC組(6.25±3.10)比較明顯增多(P<0.05)；NMD1組和NMD2組的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)(8.75±2.22)和(8.00±3.16)與PTZ組比較又明顯減少(P<0.05),但NMD1組和NMD2組與NC組比較無顯著性差異(P>0.05)；NMD1組和NMD2組比較也無顯著性差異(P>0.05).全

9、天總反應(yīng)時(shí)間四組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立的戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠模型類似人類慢性癲癇發(fā)作,且具備學(xué)習(xí)和記憶能力缺損,是研究癲癇后認(rèn)知功能障礙比較理想的動(dòng)物模型,尼莫地平可以部分改善慢性癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能缺損。 第二部分慢性癲癇大鼠海馬突觸后致密物95與突觸素表達(dá)的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬P38及PSD-95表達(dá)的變化及尼莫地平的影響,探討P38及PSD

10、-95在癲癇后認(rèn)知功能障礙中的作用與意義。 方法:每組大鼠各取8只,10％水合氯醛麻醉,4％多聚甲醛灌注固定,取含海馬腦段,石蠟包埋,冠狀切片,采用SP法行PSD-95及P38免疫組化染色,測(cè)定免疫反應(yīng)產(chǎn)物吸光度.每組大鼠各取8只,迅速分離海馬,Trizol提取總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)定大鼠海馬PSD-95 mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)論:PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬組織P38、PSD-95及PS

11、D-95 mRNA表達(dá)水平均降低,并且與大鼠學(xué)習(xí)和記憶成績下降相一致,提示P38及PSD-95可能參與了癲癇后認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制；尼莫地平可以提高癲癇大鼠海馬組織P38蛋白、PSD-95蛋白及mRNA表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)癲癇大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力改善。 第三部分慢性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)和突觸超微結(jié)構(gòu)(SVD、PSD、WSC)的變化

12、及尼莫地平的干預(yù)作用,探討突觸可塑性與癲癇后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。 方法:每組大鼠各取3只,10％水合氯醛麻醉,4％多聚甲醛(含2.5％戊二醛)灌注固定,利用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)和突觸超微結(jié)構(gòu)(SVD、PSD、WSC)的變化。 結(jié)論:癲癇大鼠海馬CA1區(qū)存在神經(jīng)元與突觸超微結(jié)構(gòu)異常,尼莫地平可以改善神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化,這些與癲癇大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化相平行,說明突觸可塑性與癲

13、癇后認(rèn)知功能障礙之間存在密切關(guān)系。 第四部分慢性癲癇大鼠海馬[Ca2+]i和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IIα的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬[Ca2+]i及CaMK IIα,P-CaMK IIα蛋白、CaMK IIα mRNA表達(dá)的變化及尼莫地平的干預(yù)作用,探討鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與癲癇后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。 方法:每組大鼠各取6只,10％水合氯醛麻醉,迅速取海馬,制備海馬組織混懸液,負(fù)載Flu

14、o-3/AM,采用流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定各組大鼠海馬細(xì)胞[Ca2+]i變化；RT-PCR方法檢測(cè)CaMK IIα mRNA表達(dá)的變化.每組大鼠各取8只,10％水合氯醛麻醉,迅速取海馬,提取海馬總蛋白及膜蛋白,Western blot方法檢測(cè)海馬CaMK IIα,P-CaMK IIα蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)論:戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬內(nèi)存在鈣超載及P-CaMK Ⅱa,CaMK Ⅱa蛋白及CaMK Ⅱa mRNA表達(dá)水平降低,導(dǎo)致鈣信號(hào)

15、轉(zhuǎn)導(dǎo)異常,可能參與了癲癇后認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制；尼莫地平可以調(diào)節(jié)海馬[Ca2+]i水平,增強(qiáng)P-CaMK Ⅱa,CaMK Ⅱa蛋白及CaMK Ⅱa mRNA表達(dá)水平,與它提高癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶成績相一致,提示尼莫地平具有改善認(rèn)知功能的藥理學(xué)作用。 第五部分慢性癲癇大鼠海馬CREB表達(dá)水平的變化及尼莫地平的影響 目的:觀察戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬P-CREB蛋白及CREBmRNA表達(dá)的變化及尼莫地平的干預(yù)作用,探討核轉(zhuǎn)錄