人參皂苷Rd誘導(dǎo)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、人參皂苷人參皂苷Rd誘導(dǎo)誘導(dǎo)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究專業(yè)名稱：藥理學(xué)研究生：楚麗麗導(dǎo)師：宛蕾教授摘要目的：目的：研究人參皂苷Rd誘導(dǎo)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究資料。方法：方法：體外培養(yǎng)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過MTT法檢測(cè)不同濃度Rd作用于U251細(xì)胞24h、48h、72h后細(xì)胞的存活率，選擇Rd作用的最佳時(shí)間，

2、并確定Rd的濃度。本實(shí)驗(yàn)分為五組：空白對(duì)照組，溶媒組（1.3%丙二醇），人參皂苷Rd低、中、高劑量組（20μmolL、40μmolL、80μmolL），選擇藥物作用48h后檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)：（1）倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；（2）線粒體琥珀酸脫氫酶（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率；（3）流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVFITCPI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期；（4）Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡；（5）免疫組化方法檢測(cè)CyclinD1、

3、Caspase3、Bcl2、Bax蛋白表達(dá)。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果：結(jié)果：（1）MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示人參皂苷Rd作用于U251細(xì)胞24h、48h、72h后均可降低細(xì)胞的存活率。同一作用時(shí)間下，隨著藥物劑量的增加細(xì)胞存活率降低，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。除去作用24h和72hRd10μmolL、20μmolL濃度組之外，其他組與空白對(duì)照組相比P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同一藥物劑量作用細(xì)胞48h后細(xì)胞的存活率均高于作用2

4、4h和72h的細(xì)胞存活率。使用SPSS軟件計(jì)算Rd作用U251細(xì)胞48h后IC50＝77.93μmolL。（2）倒置顯微鏡下觀察Rd作用細(xì)胞之后，細(xì)胞數(shù)目減少，體積變小，突起回縮，細(xì)胞間隙變大，甚至包體變圓從瓶底脫落。與空白對(duì)照組相比，藥物劑量越大，細(xì)胞形態(tài)改變?cè)矫黠@。（3）經(jīng)Hoechst33258染色后，Rd組可見典型的細(xì)胞凋亡的特征，胞核濃縮呈致密的強(qiáng)熒光團(tuán)影和凋亡小體。而空白對(duì)照組和溶媒組呈現(xiàn)均勻淡藍(lán)熒光染色。隨著給藥劑量增加，

5、細(xì)胞凋亡的特征越明顯。（4）Rd誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以早期凋亡為主，Rd低、中、高劑量組早期凋亡率分別心血管系統(tǒng)和腎臟等有獨(dú)特的保護(hù)作用；對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、促進(jìn)凋亡和分化、增加對(duì)化療藥物的敏感性、通過抑制生成新血管從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。據(jù)研究表明，Rd可通過增加p21和p27等細(xì)胞周期蛋白酶抑制基因的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶D1表達(dá)，使細(xì)胞停留在G0G1期抑制細(xì)胞增殖，并且通過下調(diào)Bcl2、上調(diào)Bax穩(wěn)定線粒體膜電位上調(diào)caspa

6、se3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于Rd有抗腫瘤作用，且無骨髓抑制、不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)正常組織毒性甚低的優(yōu)勢(shì)，因此作為抗腫瘤藥物已成為研究的熱點(diǎn)，在誘導(dǎo)肺癌、胃癌、膀胱癌和黑色素瘤等細(xì)胞凋亡和抑制血管生成方面的研究已有報(bào)導(dǎo)。但對(duì)治療膠質(zhì)細(xì)胞瘤方面尚無明確報(bào)導(dǎo)，加之Rd具有脂溶性，容易通過血腦屏障，因此我們選用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251作為研究對(duì)象，觀察Rd對(duì)其作用并探討可能的機(jī)制，為其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究資料。材料與方法材料與方

7、法1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞系細(xì)胞系U251細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞貼壁生長，DMEM完全培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)。1.2實(shí)驗(yàn)藥品及主要試劑實(shí)驗(yàn)藥品及主要試劑人參皂苷Rd(純度90%以上)貴州信邦制藥股份有限公司注射用青霉素鈉（批號(hào)D11O3223）華北制藥股份有限公司硫酸鏈霉素（批號(hào)110104）華北制藥股份有限公司DMEM高糖液體培養(yǎng)基Hyclone胎牛血清四季青胰蛋白酶碧云天生物技術(shù)研究所DMSO（分