90K-MaC-2 BP在人腦膠質(zhì)星形細胞瘤中的表達以及90K-Mac002 BP負載的樹突狀細胞疫苗抗膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf

1、第一部分、90K/Mac-2 BP在人腦星型細胞瘤中的表達
　　目的:分析90K/Mac-2 BP(Mac-2 binding protein)在人腦星型細胞瘤中的表達。
　　方法:RT-PCR檢測90K mRNA在人腦星型細胞瘤以及正常腦組織中的表達;采用WB(Western blot)和免疫組化檢測90K蛋白在人腦星型細胞瘤以及正常腦組織中的表達。
　　結(jié)果:RT-PCR發(fā)現(xiàn)90K mRNA在正常腦組織中微量表達，

2、相對表達量為0.116±0.017;而在人腦星型細胞瘤中高表達，相對表達量為0.407±0.151，與正常腦組織相比有顯著差異(t=6.065，P＜0.05)。低級別星型細胞瘤（WHOⅠ-Ⅱ級）與高級別星型細胞瘤(WHOⅢ-Ⅳ級)相對表達量分別為0.295±0.067和0.516±0.128，兩組相比有顯著差異(t=8.138，P＜0.05)。90K mRNA的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤大小沒有顯著相關關系(P＞0.05)。West

3、ern blot結(jié)果顯示在正常腦組織有少量的90K蛋白表達，而在星型細胞瘤中表達則顯著升高。正常腦組織中90K蛋白相對表達量（90K IOD值/GAPDHIOD值）為0.291±0.064，星型細胞瘤中90K蛋白相對表達量為1.163±0.391，兩組相比有顯著差異(t=15.68，P＜0.05)。低級別星型細胞瘤中90K蛋白相對表達量為0.902±0.272，高級別星型細胞瘤中90K蛋白相對表達量為1.415±0.318，兩組相比有顯

4、著差異(t=6.539，P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示90K蛋白的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤大小沒有顯著相關關系(P＞0.05)。免疫組化結(jié)果顯示正常腦組織90K蛋白表達陽性率為10％(1/10)，星形細胞瘤90K蛋白表達陽性率為70.18％(40/57)，兩組相比有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。低級別星型細胞瘤中90K蛋白表達陽性率為53.57％(15/28)，高級別星型細胞瘤中90K蛋白表達陽性率為86.2

5、1％(25/29)，兩組相比有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示90K蛋白的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤大小沒有顯著相關關系(P＞0.05)。Spearman秩相關檢驗發(fā)現(xiàn)，90K蛋白的表達水平隨著星型細胞瘤級別的升高而升高(r=0.786，P＜0.01)。
　　結(jié)論:90K mRNA與90K蛋白均在星形細胞瘤組織中高表達，在正常腦組織中微量表達;90K蛋白的表達水平與星形細胞瘤的惡性程度正相關;90K可能在星型

6、細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。90K蛋白是星形細胞瘤相關抗原，在今后星形細胞瘤的免疫治療中可能成為特異性的目標抗原。
　　第二部分、90K/Mac-2 BP負載的樹突狀細胞疫苗抗人腦星型細胞瘤的實驗研究
　　目的:分析90K蛋白在DC疫苗抗星形細胞瘤免疫治療中的作用。
　　方法:WB法檢測90K蛋白在U251細胞中的表達;采用人外周血單核細胞分化培養(yǎng)DC;采用熱凋亡法制備U251凋亡細胞，并與90K蛋白一起負載

7、DC制備腫瘤疫苗;采用ELISA檢測抗原負載DC和T淋巴細胞分泌的細胞因子;免疫磁珠法分選CD4+T細胞和CD8+T細胞;CCK-8法檢測抗原負載DC誘導的T淋巴細胞增殖反應和CTL對U251細胞的殺傷作用。實驗中抗原負載DC分為四組:未成熟DC組，成熟DC組，凋亡U251細胞-DC組和凋亡U251細胞+90K-DC組。
　　結(jié)果:WB法檢測90K蛋白在U251細胞中的表達升高。培養(yǎng)成熟的DC在光鏡和電鏡下具有典型的樹突樣結(jié)構(gòu)，流

8、式細胞儀檢測其細胞表面高表達CD80、CD86和HLA-DR。在44℃下加熱3小時的U251細胞凋亡率最高，與DC細胞融合良好。四組DC疫苗中凋亡U251細胞+90K-DC分泌的IL-12p70濃度最高，而IL-10的濃度要稍低?？乖撦dDC能夠刺激T淋巴細胞增殖，四組中凋亡U251細胞+90K-DC組刺激T淋巴細胞增殖能力最強。免疫磁珠法分選的CD4+T細胞和CD8+T細胞具有很高的細胞純度?？乖撦dDC能夠刺激CD4+T細胞分化為T

9、h1細胞并分泌IFN-γ，四組中凋亡U251細胞+90K-DC組刺激CD4+T細胞分化為Th1細胞并分泌IFN-γ的濃度最高?？乖撦dDC能夠刺激CD8+T細胞活化為CTL細胞并分泌IFN-γ，四組中凋亡U251細胞+90K-DC組刺激CD8+T細胞活化為CTL細胞并分泌IFN-γ的濃度最高。抗原負載DC刺激CD8+T細胞活化為CTL后具有殺傷U251細胞作用，四組中凋亡U251細胞+90K-DC組刺激CD8+T細胞活化為CTL細胞殺傷

10、U251細胞的作用最強。
　　結(jié)論:經(jīng)過人外周靜脈血中單核細胞分化而來的DC具有典型的形態(tài)特征和免疫表型，可為制備DC腫瘤疫苗提供可靠穩(wěn)定的DC細胞來源。經(jīng)過熱凋亡U251細胞和90K蛋白共同負載的DC在體外能夠誘導T淋巴細胞的增殖。免疫磁珠法分選的CD4+T細胞和CD8+T細胞具有很高的細胞純度。熱凋亡U251細胞和90K蛋白共同負載的DC疫苗能夠誘導抗原特異性CTL殺傷U251細胞，其殺傷U251細胞的作用比單獨應用熱凋亡U2