促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽及其受體系統(tǒng)在大鼠糖尿病神經(jīng)病變中的作用.pdf

1、糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，早期癥狀主要為感覺的障礙，臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性的疼痛和/或感覺異常，以下肢遠(yuǎn)端為著，晚期可出現(xiàn)下肢的潰瘍，糖尿病足，甚至導(dǎo)致截肢。不幸的是，由于對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的病理生理機(jī)制認(rèn)知的缺乏，目前的治療效果并不理想。在糖尿病中，病理學(xué)上出現(xiàn)周圍神經(jīng)纖維萎縮、脫髓鞘、纖維丟失和再生障礙，但其發(fā)生進(jìn)展機(jī)制尚不完全清楚。
　　 促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽(galanin，Gal)是一種高度保守和廣泛分布在中樞

2、和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)肽。它參與和調(diào)節(jié)體內(nèi)許多重要的生理、病理過程，例如痛覺調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)內(nèi)分泌、認(rèn)知、癲癇和腫瘤等，尤其是前兩者，是近年研究的熱點(diǎn)。Gal的所有功能由其G蛋白耦聯(lián)的受體所介導(dǎo)。Gal受體1(galaninreceptor1，GalR1)和Gal受體2（galaninreceptor2，GalR2）廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)節(jié)中。Gal受體都可以通過耦聯(lián)Gi/o蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化。但不同的是GalR2

3、還可以和Gq/11耦聯(lián)，從而激活磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)和蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)。
　　 在正常的情況下，Gal在背根神經(jīng)節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）的部分小神經(jīng)元和脊髓灰質(zhì)第Ⅱ?qū)幽z狀質(zhì)中的神經(jīng)元中低表達(dá)，而在周圍神經(jīng)損傷后，其表達(dá)明顯上調(diào)，這很可能是神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)損傷后的適應(yīng)性反應(yīng)。DRG和脊髓灰質(zhì)后角(spinaldorsalhorn，SDH)中Gal

4、表達(dá)的上調(diào)，在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下起著重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明鞘內(nèi)注射Gal可以減輕神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛。目前許多的研究表明，Gal的鎮(zhèn)痛功能由GalR1介導(dǎo)，但其確切的抑制疼痛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。GalR2通過耦聯(lián)Gq/11激活PLC和PKC，繼而激活A(yù)kt和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)保護(hù)和促進(jìn)軸突再生的功能。
　　 已有研究表明Gal及其受體GalR1和GalR2在多種類型的神經(jīng)病變中發(fā)揮著重要的作用

5、，但其在糖尿病神經(jīng)病變發(fā)病過程中的作用，目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的坐骨神經(jīng)損傷后，表達(dá)Gal的神經(jīng)纖維再生延遲，并可能加重了神經(jīng)病理性疼痛。進(jìn)一步探討Gal及其受體系統(tǒng)在糖尿病神經(jīng)病變中的作用及其機(jī)制，對(duì)開展糖尿病神經(jīng)病變的治療新戰(zhàn)略具有重要意義。
　　 本課題運(yùn)用體內(nèi)、外模型和多種實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)Gal及其受體GalR1和GalR2在糖尿病神經(jīng)病變中的痛覺調(diào)節(jié)與神經(jīng)保護(hù)中的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第一部分，促生

6、長(zhǎng)激素神經(jīng)肽對(duì)體外高糖培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的影響作用
　　 高血糖被認(rèn)為是引起糖尿病神經(jīng)病變的主要原因。高血糖的糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展成為某種形式的糖尿病神經(jīng)病變。高濃度的葡萄糖能引起神經(jīng)元損傷，這被認(rèn)為是糖尿病神經(jīng)病變的一個(gè)決定性因素。實(shí)驗(yàn)證明，高糖可引起體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元凋亡。Gal不僅參與體內(nèi)的血糖和能量調(diào)節(jié)，而且具有神經(jīng)元保護(hù)作用。但Gal對(duì)體外高糖培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元的作用及其受體的影響，尚不清楚。
　　 基

7、于以上研究背景，本課題設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn):
　　 胎齡為15d（embryonicday15，E15）胚胎大鼠的DRG神經(jīng)元，體外分散培養(yǎng)48h后，隨機(jī)分為5組:(1)高糖組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium內(nèi)加入葡萄糖至終濃度為45mmol/L;(2)高糖+Gal組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium內(nèi)加入葡萄糖至終濃度為45mmol/L，加入Gal至終濃度1μmol/L;(

8、3)Gal組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium內(nèi)加入Gal至終濃度1μmol/L;(4)甘露醇組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium加入甘露醇至終濃度20mmol/L，模擬高糖引起的高滲環(huán)境;(5)對(duì)照組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium，不施加任何干預(yù)因素。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)水平，檢測(cè)細(xì)胞的活性

9、，檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活，觀察Hoechst33342染色細(xì)胞核形態(tài)的改變，Real-timeRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)Gal及其受體GalR1和GalR2的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)高糖培養(yǎng)可致DRG神經(jīng)元胞內(nèi)ROS水平升高，細(xì)胞活性下降，caspase-3激活，細(xì)胞凋亡，并引起Gal表達(dá)上升，GalR1表達(dá)下降。
　　 (2)外源性的Gal可

10、以顯著減輕高糖所致的神經(jīng)元ROS水平升高和活性下降，減少caspase-3的激活和細(xì)胞的凋亡。外源性的Gal顯著減輕高糖所致的Gal表達(dá)上升，但可進(jìn)一步下調(diào)GalR1的表達(dá)。
　　 (3)各種實(shí)驗(yàn)條件對(duì)DRG神經(jīng)元GalR2的表達(dá)無顯著影響。
　　 以上結(jié)果表明，Gal及其受體系統(tǒng)參與了體外高糖分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元損傷過程。DRG神經(jīng)元中Gal和GalR1在高糖或外源性Gal的培養(yǎng)條件下表達(dá)具有可塑性，而GalR2的表

11、達(dá)則變化不明顯;外源性Gal可以減少體外分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元高糖損傷所引起的凋亡。Gal對(duì)高糖損傷的DRG神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討Gal及其受體在糖尿病神經(jīng)病變中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。
　　 第二部分，促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽對(duì)糖尿病神經(jīng)病變大鼠疼痛的作用及其機(jī)制
　　 糖尿病神經(jīng)病變能引起痛覺過敏和異常性疼痛，但引起這種神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制尚不清楚。DRG神經(jīng)元是感覺傳導(dǎo)通路的第一級(jí)神經(jīng)元

12、，參與了糖尿病神經(jīng)病變。已經(jīng)證實(shí)DRG是糖尿病感覺性神經(jīng)病變的最常累及的組織之一。SDH是感覺尤其是痛覺傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)的重要中樞，有研究表明它也參與了糖尿病中神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)。已有實(shí)驗(yàn)證明，Gal及其受體參與了神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)。本課題研究了Gal及其受體在鏈唑霉素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用。
　　 腹膜腔注射STZ(55mg/kg)誘導(dǎo)大鼠發(fā)生糖尿病，建立糖尿病神經(jīng)性疼痛的模

13、型。Real-timeRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)DRG及SDH中Gal、GalR1和GalR2的表達(dá)。鞘內(nèi)注射Gal、Gal拮抗劑M35、選擇性GalR1激動(dòng)劑M617、選擇性GalR2激動(dòng)劑AR-M1896，用vonFreyfilaments檢測(cè)大鼠觸覺痛覺閾值。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠在第4w后可以產(chǎn)生穩(wěn)定的觸覺痛覺閾值下降，至少持續(xù)到第12w。
　　 (2)

14、GalR1的表達(dá)在糖尿病大鼠DRG內(nèi)下降，SDH內(nèi)不變。
　　 (3)GalR2的表達(dá)在糖尿病大鼠DRG和SDH內(nèi)下降。
　　 (4)外源性Gal可以減輕糖尿病大鼠痛覺過敏，提高觸覺痛覺閾值。Gal拮抗劑M35可以阻斷這種作用。
　　 (5)鞘內(nèi)注射選擇性GalR1激動(dòng)劑M617可以提高糖尿病大鼠觸覺痛覺閾值，而GalR2激動(dòng)劑AR-M1896則未能發(fā)揮作用。
　　 以上結(jié)果表明，Gal及其受體系統(tǒng)參與了

15、糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)。通過激活GalR1而不是GalR2可以減輕糖尿病引起的神經(jīng)病理性疼痛，從而使GalR1可能成為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的新的潛在治療靶點(diǎn)。糖尿病神經(jīng)病變中，Gal受體在DRG和或SDH中的表達(dá)下降，這種現(xiàn)象可能是糖尿病神經(jīng)病變中的疼痛和神經(jīng)損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究糖尿病神經(jīng)病變，開發(fā)新的藥物提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第三部分，促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽對(duì)糖尿病神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)損傷的保護(hù)作用<

16、br>　　 糖尿病神經(jīng)病變能引神經(jīng)病理性疼痛、周圍神經(jīng)的損傷以及再生障礙，但引起這些神經(jīng)病變的機(jī)制尚不清楚。本課題的第二部分證實(shí)了Gal及其受體參與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)，本部分將進(jìn)一步研究探討Gal及其受體在STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)損傷后在神經(jīng)病理性疼痛和神經(jīng)再生中的作用。
　　 大鼠STZ誘導(dǎo)糖尿病12w后，與相同年齡正常大鼠隨機(jī)分為6組:(1)糖尿病手術(shù)+Gal組:糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)夾傷后，每天鞘內(nèi)注射外源性3μ

17、gGal。(2)糖尿病手術(shù)組:糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)夾傷。(3)糖尿病假手術(shù)組:糖尿病大鼠假手術(shù)，不損傷坐骨神經(jīng)。(4)正常手術(shù)+Gal組:正常大鼠坐骨神經(jīng)夾傷后，每天鞘內(nèi)注射外源性3μgGal。(2)正常手術(shù)組:正常大鼠坐骨神經(jīng)夾傷。(3)正常假手術(shù)組:正常大鼠假手術(shù)，不損傷坐骨神經(jīng)。檢測(cè)各組大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值，觀察各組大鼠趾寬的恢復(fù)、神經(jīng)傳導(dǎo)速度(nerveconductionvelocity,NCV)和坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)的變化，

18、檢測(cè)各組大鼠DRG和SDH內(nèi)Gal、GalR1和GalR2的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)坐骨神經(jīng)夾傷可加重糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛，使觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值下降。
　　 (2)外源性Gal可顯著減輕糖尿病和正常大鼠坐骨神經(jīng)夾傷引起的神經(jīng)病理性疼痛，提高大鼠的觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值。
　　 (3)外源性Gal可顯著改善糖尿病和正常大鼠的趾寬、NCV，促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生。
　　 (4)

19、DRG和SDH內(nèi)Gal、GalR1和GalR2的表達(dá)在各種不同的實(shí)驗(yàn)條件下具有可塑性。
　　 以上結(jié)果表明，Gal及其受體系統(tǒng)參與了糖尿病神經(jīng)病變的病理發(fā)生過程。在DRG和SDH中，內(nèi)源性Gal、GalR1和GalR2在糖尿病神經(jīng)病變大鼠的坐骨神經(jīng)夾傷后的表達(dá)變化與糖尿病神經(jīng)病變的病理發(fā)生進(jìn)程有一定的關(guān)系。外源性Gal可以明顯改善糖尿病神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的痛覺過敏狀態(tài)、NCV，加速趾寬恢復(fù)，促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生。本課題為進(jìn)一