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文檔簡介
1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述:
第一章 成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞分離培養(yǎng),PLB及SERCA2a重組腺病毒載體的純化及轉(zhuǎn)染
目的:
分離得到成年大鼠原代心肌細(xì)胞并成功培養(yǎng),分離、純化包含犬PLB和SERCA的腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染至分離成功的大鼠原代心肌細(xì)胞中;
方法:
采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞,進(jìn)一步分離純化包含犬PLB和S
2、ERCA的腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中,觀察細(xì)胞存活時(shí)間及細(xì)胞狀態(tài),通過免疫組化法、western blot、calcium-imaging觀察未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染成功后,心肌細(xì)胞PLB及SERCA分布、單個(gè)細(xì)胞功能等。
結(jié)果:
1.成功分離出大鼠原代心肌細(xì)胞,分離存活率穩(wěn)定在70-80%,并可穩(wěn)定培養(yǎng)3-5天;
2.包含犬PLB和SERCA2a的腺病毒載體經(jīng)分離純化,效價(jià)比較高,并可成功轉(zhuǎn)染cos
3、-1細(xì)胞,肉眼觀測轉(zhuǎn)染成功率達(dá)80%以上,western blot檢測到新生蛋白成功表達(dá),且含量隨病毒濃度增加呈遞增趨勢;
結(jié)論:
Lan'gendorff灌流法分離大鼠原代心肌細(xì)胞方法有效可行,成功率高,分離純化重組腺病毒載體方法成熟且轉(zhuǎn)染率高,分離及轉(zhuǎn)染后原代心肌細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定,可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
第二章 正常SD大鼠原代心肌細(xì)胞中新生PLB及SERCA2a運(yùn)輸途徑及其對心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動、鈣離子通道的影響
4、
目的:
通過觀察大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后,觀察新生PLB和SERCA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,探討該新生轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動及L型鈣離子通道的影響;
方法:
健康成年SD大鼠8只,采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞,包含犬PLB和SERCA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中,觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h
5、存活細(xì)胞狀態(tài),通過免疫組化法、western blot、calcium-imaging、膜片鉗等方法觀察心肌細(xì)胞中新生成的PLB及SERCA分布、由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑、對細(xì)胞鈣離子電流的影響等。結(jié)果以x±s表示,多組之間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用方差分析,不同距離/時(shí)間點(diǎn)資料的比較應(yīng)用重復(fù)測量方差分析,p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS24.0軟件完成。
結(jié)果:
1.8
6、只SD大鼠均成功分離出原代心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功,并可培養(yǎng)24h、48h、72h;
2.正常原代心肌細(xì)胞中,PLB在核膜及肌漿網(wǎng)上均有分布,且兩者分布含量大于2∶1; SERCA2a在核膜及肌漿網(wǎng)上同樣均有分布,且兩者分布含量約為1∶1,p<0.05;
3.包含犬PLB/SERCA2a的重組腺病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞后,24h熒光染色結(jié)果可見PLB主要局限在核膜上,而SERCA2a已經(jīng)開始由核膜向外擴(kuò)散,觀察48h熒光染色
7、結(jié)果發(fā)現(xiàn),PLB仍然以核膜為主,部分分布在肌漿網(wǎng)上,SERCA2a則已經(jīng)完全分布至肌漿網(wǎng),接近自身穩(wěn)態(tài)的分布;72h觀察兩者均已達(dá)到穩(wěn)態(tài)分布,westernblot結(jié)果與熒光染色觀察結(jié)果一直,細(xì)胞內(nèi)新生的PLB/SERCA2a含量隨著時(shí)間延長呈遞增趨勢;
4.對比轉(zhuǎn)染前后心肌細(xì)胞鈣成像及全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果,轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動并未發(fā)生明顯改變,L型鈣通道電流沒有明顯影響,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
結(jié)論:
8、正常大鼠心肌細(xì)胞中新生PLB及SERCA2a遵循NEST途徑轉(zhuǎn)運(yùn),PLB在轉(zhuǎn)運(yùn)途中在核膜上的滯留及其自身的分布特點(diǎn)對正常心肌細(xì)胞的鈣調(diào)控未見明顯影響。
第三章 心肌梗死SD大鼠原代心肌細(xì)胞PLB及SERCA2a的運(yùn)輸途徑,及其對心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動、鈣離子電流的影響
目的:
心肌梗死大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后,觀察新生PLB和SERCA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,探討該新生轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對心肌細(xì)胞自
9、發(fā)鈣活動及鈣離子通道的影響;
方法:
健康成年SD大鼠8只,結(jié)扎前降支構(gòu)建梗死模型,造模成功后飼養(yǎng)4周,采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞,將含犬PLB和SERCA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中,觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,存活細(xì)胞狀態(tài),通過免疫組化法、western blot法、 calcium-imaging、全細(xì)胞膜片鉗等方法觀察心肌細(xì)胞中新
10、生成的PLB及SERCA分布、由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑、對心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動、相關(guān)電生理功能的影響等。結(jié)果以x±s表示,多組之間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用方差分析,不同距離/時(shí)間點(diǎn)資料的比較應(yīng)用重復(fù)測量方差分析,p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS24.0軟件完成
結(jié)果:
1.8只心梗大鼠均成功分離出原代心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后可成功培養(yǎng)24h、48h、72h;
2.心梗鼠
11、的腺病毒轉(zhuǎn)染后的原代心肌細(xì)胞中,24h熒光染色結(jié)果可見PLB主要局限在核膜上,而SERCA2a已經(jīng)開始由核膜向外擴(kuò)散,觀察48h熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),PLB仍然以核膜為主,SERCA2a則已經(jīng)完全分布至肌漿網(wǎng),接近自身穩(wěn)態(tài)的分布;72h觀察兩者均已達(dá)到穩(wěn)態(tài)分布,western blot結(jié)果與熒光染色觀察結(jié)果一直,細(xì)胞內(nèi)新生的PLB/SERCA2a含量隨著時(shí)間延長呈遞增趨勢;
3.對比轉(zhuǎn)染前后心梗鼠心肌細(xì)胞鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果,轉(zhuǎn)染后的心
12、肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動明顯增加,熒光強(qiáng)度較未轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞增強(qiáng)(p<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);采用全細(xì)胞膜片鉗記錄未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的心肌細(xì)胞L型鈣通道電流,分別記錄轉(zhuǎn)染、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞各12個(gè),記錄到的鈣電流在轉(zhuǎn)染后,較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鈣電流減少,p<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
心梗大鼠心肌細(xì)胞中新生PLB及SERCA2a同樣遵循NEST途徑轉(zhuǎn)運(yùn),PLB在轉(zhuǎn)運(yùn)途中在核膜上的滯留時(shí)間較正常細(xì)胞延長,與未轉(zhuǎn)染細(xì)
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