受磷蛋白及鈣--ATP酶的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)正常及心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞鈣調(diào)控的影響.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一章 成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)，PLB及SERCA2a重組腺病毒載體的純化及轉(zhuǎn)染
　　目的：
　　分離得到成年大鼠原代心肌細(xì)胞并成功培養(yǎng)，分離、純化包含犬PLB和SERCA的腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染至分離成功的大鼠原代心肌細(xì)胞中;
　　方法：
　　采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞，進(jìn)一步分離純化包含犬PLB和S

2、ERCA的腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中，觀察細(xì)胞存活時(shí)間及細(xì)胞狀態(tài)，通過免疫組化法、western blot、calcium-imaging觀察未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染成功后，心肌細(xì)胞PLB及SERCA分布、單個(gè)細(xì)胞功能等。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離出大鼠原代心肌細(xì)胞，分離存活率穩(wěn)定在70-80％，并可穩(wěn)定培養(yǎng)3-5天;
　　2.包含犬PLB和SERCA2a的腺病毒載體經(jīng)分離純化，效價(jià)比較高，并可成功轉(zhuǎn)染cos

3、-1細(xì)胞，肉眼觀測(cè)轉(zhuǎn)染成功率達(dá)80％以上，western blot檢測(cè)到新生蛋白成功表達(dá)，且含量隨病毒濃度增加呈遞增趨勢(shì);
　　結(jié)論：
　　Lan'gendorff灌流法分離大鼠原代心肌細(xì)胞方法有效可行，成功率高，分離純化重組腺病毒載體方法成熟且轉(zhuǎn)染率高，分離及轉(zhuǎn)染后原代心肌細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　第二章 正常SD大鼠原代心肌細(xì)胞中新生PLB及SERCA2a運(yùn)輸途徑及其對(duì)心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動(dòng)、鈣離子通道的影響

4、
　　目的：
　　通過觀察大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，觀察新生PLB和SERCA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，探討該新生轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對(duì)心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動(dòng)及L型鈣離子通道的影響;
　　方法：
　　健康成年SD大鼠8只，采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞，包含犬PLB和SERCA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中，觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h

5、存活細(xì)胞狀態(tài)，通過免疫組化法、western blot、calcium-imaging、膜片鉗等方法觀察心肌細(xì)胞中新生成的PLB及SERCA分布、由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑、對(duì)細(xì)胞鈣離子電流的影響等。結(jié)果以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用方差分析，不同距離/時(shí)間點(diǎn)資料的比較應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS24.0軟件完成。
　　結(jié)果：
　　1.8

6、只SD大鼠均成功分離出原代心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功，并可培養(yǎng)24h、48h、72h;
　　2.正常原代心肌細(xì)胞中，PLB在核膜及肌漿網(wǎng)上均有分布，且兩者分布含量大于2∶1; SERCA2a在核膜及肌漿網(wǎng)上同樣均有分布，且兩者分布含量約為1∶1，p＜0.05;
　　3.包含犬PLB/SERCA2a的重組腺病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞后，24h熒光染色結(jié)果可見PLB主要局限在核膜上，而SERCA2a已經(jīng)開始由核膜向外擴(kuò)散，觀察48h熒光染色

7、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLB仍然以核膜為主，部分分布在肌漿網(wǎng)上，SERCA2a則已經(jīng)完全分布至肌漿網(wǎng)，接近自身穩(wěn)態(tài)的分布;72h觀察兩者均已達(dá)到穩(wěn)態(tài)分布，westernblot結(jié)果與熒光染色觀察結(jié)果一直，細(xì)胞內(nèi)新生的PLB/SERCA2a含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì);
　　4.對(duì)比轉(zhuǎn)染前后心肌細(xì)胞鈣成像及全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動(dòng)并未發(fā)生明顯改變，L型鈣通道電流沒有明顯影響，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　結(jié)論：
　　

8、正常大鼠心肌細(xì)胞中新生PLB及SERCA2a遵循NEST途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，PLB在轉(zhuǎn)運(yùn)途中在核膜上的滯留及其自身的分布特點(diǎn)對(duì)正常心肌細(xì)胞的鈣調(diào)控未見明顯影響。
　　第三章 心肌梗死SD大鼠原代心肌細(xì)胞PLB及SERCA2a的運(yùn)輸途徑，及其對(duì)心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動(dòng)、鈣離子電流的影響
　　目的：
　　心肌梗死大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，觀察新生PLB和SERCA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，探討該新生轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對(duì)心肌細(xì)胞自

9、發(fā)鈣活動(dòng)及鈣離子通道的影響;
　　方法：
　　健康成年SD大鼠8只，結(jié)扎前降支構(gòu)建梗死模型，造模成功后飼養(yǎng)4周，采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細(xì)胞，將含犬PLB和SERCA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞中，觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，存活細(xì)胞狀態(tài)，通過免疫組化法、western blot法、 calcium-imaging、全細(xì)胞膜片鉗等方法觀察心肌細(xì)胞中新

10、生成的PLB及SERCA分布、由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑、對(duì)心肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動(dòng)、相關(guān)電生理功能的影響等。結(jié)果以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用方差分析，不同距離/時(shí)間點(diǎn)資料的比較應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS24.0軟件完成
　　結(jié)果：
　　1.8只心梗大鼠均成功分離出原代心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后可成功培養(yǎng)24h、48h、72h;
　　2.心梗鼠

11、的腺病毒轉(zhuǎn)染后的原代心肌細(xì)胞中，24h熒光染色結(jié)果可見PLB主要局限在核膜上，而SERCA2a已經(jīng)開始由核膜向外擴(kuò)散，觀察48h熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLB仍然以核膜為主，SERCA2a則已經(jīng)完全分布至肌漿網(wǎng)，接近自身穩(wěn)態(tài)的分布;72h觀察兩者均已達(dá)到穩(wěn)態(tài)分布，western blot結(jié)果與熒光染色觀察結(jié)果一直，細(xì)胞內(nèi)新生的PLB/SERCA2a含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì);
　　3.對(duì)比轉(zhuǎn)染前后心梗鼠心肌細(xì)胞鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)染后的心

12、肌細(xì)胞自發(fā)鈣活動(dòng)明顯增加，熒光強(qiáng)度較未轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞增強(qiáng)(p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);采用全細(xì)胞膜片鉗記錄未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的心肌細(xì)胞L型鈣通道電流，分別記錄轉(zhuǎn)染、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞各12個(gè)，記錄到的鈣電流在轉(zhuǎn)染后，較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鈣電流減少，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　心梗大鼠心肌細(xì)胞中新生PLB及SERCA2a同樣遵循NEST途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，PLB在轉(zhuǎn)運(yùn)途中在核膜上的滯留時(shí)間較正常細(xì)胞延長(zhǎng)，與未轉(zhuǎn)染細(xì)