shRNA抑制人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa細胞Her-2-neu基因表達的研究.pdf

1、目的：觀察質(zhì)粒載體介導的shRNA干擾技術能否有效抑制人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa HER—2基因的表達。RT-PCR法檢測實驗組和對照組之間轉(zhuǎn)染后mRNA水平之間是否有差異。Western Blot法檢測實驗組和對照組之間轉(zhuǎn)染后P185蛋白表達是否有差異。 方法：Ishikawa細胞購自于湘雅醫(yī)學院細胞研究所。利用Ambion公司提供的RNAi design tool設計出兩條針對HER—2/neu基因的特異性短發(fā)夾狀R

2、NA(shRNA)，GC比率在45％到55％之間。選用pSilencer4，1—CMV vectors(Ambion)作為質(zhì)粒載體，構建兩條針對HER2基因的特異性重組質(zhì)粒。首先進行細胞傳代，傳至足夠數(shù)量的細胞后凍存?zhèn)溆?。利用大腸桿菌JM109作為感受態(tài)菌進行大量的質(zhì)粒擴增，以儲備足夠數(shù)量的質(zhì)粒，用lp2000作為媒介轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞。試驗分為三組，即shRNA—HER2—1組、shRNA—HER2—2組和表達非特異短發(fā)夾狀sh

3、RNA—CON的真核表達載體的陰性對照組。三組shRNA的真核表達載體轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞后，RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72h HER2基因mRNA的表達。Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72h HER2基因P185蛋白的表達，對比三組之間的差異。 結(jié)果：經(jīng)鑒定證實真核表達載體shRNA—HER2—1、shRNA—HER2—2與shRNA—CON均構建成功。RT-PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后

4、24h、48h及72h后Her—2/neu1與Her—2/neu2組的mRNA水平分別下降為非特異Her—2/neu con組的70.1％和80.2％、60.2％和71.2％以及69.3％和78.5％，證實了兩特異重組質(zhì)粒在mRNA水平上均能抑制her—2基因的表達。而Western Blot法檢測P185蛋白水平分別下降為非特異Her—2/neu con組的79.1％和82.3％、57.2％和67.8％以及68.4％和73.3％，亦證