急性鎘脅迫對(duì)斑馬魚(yú)感染嗜水氣單胞菌后早期炎性因子應(yīng)答的影響.pdf

1、本學(xué)位論文首先建立了鎘（Cadmium，Cd）脅迫和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）攻毒斑馬魚(yú)（Danio rerio）的濃度模型。用不同濃度鎘（0、2、4、6、8和10 mg/L）脅迫斑馬魚(yú)，觀察96 h之內(nèi)出現(xiàn)的癥狀并統(tǒng)計(jì)死亡率。其次驗(yàn)證了嗜水氣單胞菌的毒力基因，經(jīng)鑒定合格后，通過(guò)腹腔注射斑馬魚(yú)50μL不同濃度的細(xì)菌（0、9.458×105、9.458×106、1.892×107、9.458×107和9.45

2、8×108cfu/ml），觀察7 d之內(nèi)的感染癥狀并統(tǒng)計(jì)死亡率。分析得到半致死濃度，建立鎘脅迫及嗜水氣單胞菌攻毒斑馬魚(yú)模型。然后，探究了不同濃度鎘（0、0.23和1.15 mg/L）處理斑馬魚(yú)后五種組織（腎臟、脾臟、肝臟、鰓和腸道）八個(gè)常用內(nèi)參基因的表達(dá)變化；選取表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，繼續(xù)評(píng)估它們?cè)阪k脅迫后腹腔注射嗜水氣單胞菌12 h和9 d之后的表達(dá)情況。最后，為了探究急性鎘脅迫前后斑馬魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫應(yīng)答早期變化，根據(jù)以上結(jié)

3、果設(shè)置了不同的鎘濃度組（0、0.23、1.15和5.75mg/L）。處理96 h后每個(gè)濃度組斑馬魚(yú)隨機(jī)分為兩個(gè)亞組：分別注射PBS和嗜水氣單胞菌，12 h后采用實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR方法檢測(cè)腎臟、脾臟和肝臟中早期炎性因子il-1β、il-6、il-8和tnf-α的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)結(jié)果又進(jìn)一步研究了對(duì)照組（0 mg/L）和最高濃度鎘組（5.75 mg/L）處理96 h，注射細(xì)菌0、6、12、24和48 h之后早期炎性因子的應(yīng)答變化。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.建立了鎘脅迫及嗜水氣單胞菌攻毒斑馬魚(yú)模型
　　根據(jù)斑馬魚(yú)死亡情況并計(jì)算死亡率，分析得到急性鎘脅迫斑馬魚(yú)96 h的半數(shù)致死濃度LC50為5.8 mg/L，嗜水氣單胞菌感染斑馬魚(yú)7 d的半數(shù)致死劑量LD50為2.7×106 cfu。
　　2.分析了鎘脅迫及細(xì)菌感染斑馬魚(yú)后參比基因的穩(wěn)定性
　　鎘脅迫后在五種組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的四個(gè)參照基因分別依次為：（1）腎臟：rplp2、rpl7、β-act

5、in和ef1α；（2）脾臟：β-actin、gapdh、ef1α和rpl13α；（3）肝臟：rpl7、rpl13α、β-actin和ef1α；（4）鰓：rplp2、gapdh、rnf7和ef1α；（5）腸道：ef1α、rnf7、rplp2和rpl13α。鎘脅迫后注射嗜水氣單胞菌12 h和9 d之后：ef1α在腎臟和脾臟中，rpl13α在肝臟中， rplp2在腸道中相對(duì)來(lái)說(shuō)表達(dá)最穩(wěn)定。在鰓中，注射嗜水氣單胞菌12 h后ef1α表達(dá)相對(duì)較為

6、穩(wěn)定，而9 d之后gapdh相對(duì)于ef1α更加穩(wěn)定。
　　3.探究了急性鎘脅迫后斑馬魚(yú)免疫器官對(duì)嗜水氣單胞菌的應(yīng)答變化
　　在不同濃度組，三種組織中注射嗜水氣單胞菌的亞組內(nèi)四個(gè)基因（il-1β、il-6、il-8和 tnf-α）的mRNA表達(dá)水平均高于注射PBS的亞組，大多數(shù)都呈現(xiàn)顯著（p<0.05）或極顯著（p<0.01）差異；在不同濃度組間，注射 PBS的亞組之間沒(méi)有明顯差異，而注射嗜水氣單胞菌后高鎘濃度（5.75 mg

7、/L）組的斑馬魚(yú)腎臟中il-1β（p<0.01）、il-6（p<0.01）和il-8（p<0.01）基因，脾臟和肝臟中il-1β（p<0.05）和il-8（p<0.01）基因相對(duì)于對(duì)照組中注射嗜水氣單胞菌組出現(xiàn)了顯著性上調(diào)。在嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中，對(duì)照組和高濃度鎘處理組（5.75 mg/L），斑馬魚(yú)腎臟、脾臟和肝臟中四個(gè)基因的mRN A表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。在注射嗜水氣單胞菌后不同時(shí)間點(diǎn)：鎘脅迫組（5.75 mg/L）腎臟中四個(gè)

8、基因mRNA表達(dá)水平均高于相應(yīng)的對(duì)照組，其中il-6基因在嗜水氣單胞菌感染后6 h和48 h分別呈現(xiàn)顯著（p<0.05）和極顯著（p<0.01）差異；il-8基因和tnf-α基因在嗜水氣單胞菌感染后48 h呈現(xiàn)出極顯著（p<0.01）異；脾臟中il-1β基因在細(xì)菌感染后0 h呈現(xiàn)顯著（p<0.05）差異；肝臟中il-1β基因在細(xì)菌感染后0 h和48 h呈現(xiàn)極顯著（p<0.01）差異；il-6、il-8和tnf-α基因在嗜水氣單胞菌感染后

9、48 h呈現(xiàn)出顯著（p<0.05）或極顯著（p<0.01）差異。
　　綜合以上研究結(jié)果，得出如下結(jié)論：
　　1.急性鎘脅迫和嗜水氣單胞菌攻毒斑馬魚(yú)，濃度越高，死亡現(xiàn)象出現(xiàn)越早，最終累計(jì)死亡率越大，表明兩種脅迫因子對(duì)斑馬魚(yú)的致死率具有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。高濃度鎘脅迫，引起斑馬魚(yú)鰓、腹部及尾部充血或出血；嗜水氣單胞菌的毒力基因在體內(nèi)大量表達(dá)，引起斑馬魚(yú)呼吸困難、腹部紅腫甚至出血現(xiàn)象。
　　2.急性鎘脅迫和嗜水氣單胞菌攻毒