乳腺癌細(xì)胞中MDM2調(diào)控p73α與ERα相互作用.pdf

1、目的：
　　本課題研究人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中MDM2調(diào)控p73α與ERα相互作用機(jī)制。
　　方法：
　　通過(guò)脂質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法上調(diào)p73α、ERα、MDM2表達(dá)及通過(guò)siRNA干擾下調(diào)MDM2表達(dá)，結(jié)合免疫共沉淀（Co-IP）分別檢測(cè)MDM2與p73α、ERα之間蛋白的相互結(jié)合及通過(guò)蛋白印跡（Western Blot)檢測(cè)p73α、ERα、MDM2蛋白表達(dá)情況。
　　1.免疫共沉淀法（Co-IP）檢測(cè)MDM2與E

2、Rα、p73α之間蛋白的相互結(jié)合：
　　實(shí)驗(yàn)分組：第1組（PcDNA group）、第2組(p73α group)、第3組（ERα group）、第4組（p73α and ERα group）、第5組（p73α and MDM2 group），按分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，分別于18h后加入MG-132蛋白酶抑制劑作用6 h，通過(guò)抗M DM2多克隆抗體結(jié)合MDM2抗原，最后用蛋白A-瓊脂糖珠子（Protein A-Agarose）將抗原抗體

3、復(fù)合物捕獲，經(jīng)免疫印跡檢測(cè)蛋白之間相互結(jié)合。
　　2.蛋白印跡（Western Blot)檢測(cè)目的蛋白p73α、ERα、MDM2的表達(dá)：通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體瞬間轉(zhuǎn)染法分別將 p73α、ERα、MDM2質(zhì)粒及MDM2 siRNA按分組轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，通過(guò)蛋白印跡法（Western Blot)分別檢測(cè)p73α、ERα、M DM2在蛋白水平的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、Co-IP顯示，MDM2能與p73?、ERα結(jié)合形成

4、復(fù)合體。
　　2、Western Blot顯示，MDM2能下調(diào)p73α表達(dá)及上調(diào)ERα表達(dá)。第2組（p73α group）與第7組（p73α and MDM2 group）中p73α的灰度比值（1.02±0.01,0.00±0.00 P<0.01）。第3組（ERα group）與第5組(ERα and MDM2 gro up)中ERα的灰度比值（1.15±0.02,1.37±0.06 P<0.01）。
　　3、Western

5、 Blot顯示，MDM2能下調(diào)p73α表達(dá)，降低p73α對(duì)ERα的抑制作用而上調(diào)ERα表達(dá)。第4組（p73α and ERα group）與第7組（p73α,ERα and MDM2 group）中p73α的灰度比值（0.72±0.02,0.00±0.00P<0.01），ERα的灰度比值（0.80±0.02,1.29±0.02 P<0.01）。
　　4、Western Blot顯示，MDM2 siRNA能上調(diào)p73α表達(dá)，增強(qiáng)p7

6、3α對(duì)ERα抑制作用而下調(diào)ERα表達(dá)。第4組（p73α and ERα group）與第5組（p73α,ERαand MDM2siRNA group）中p73α的灰度比值（0.48±0.01,1.30±0.01P<0.01），ERα的灰度比值（0.39±0.02,0.00±0.00 P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1. MCF-7乳腺癌細(xì)胞中MDM2蛋白能與ERα、p73α蛋白結(jié)合形成復(fù)合體。
　　2. MCF-7乳