肺結(jié)核患者外周γδT細(xì)胞Vδ2-CDR3序列特征及其合成多肽結(jié)合抗原肽的篩選和鑒定.pdf

1、研究背景：許多研究已證實(shí)γδ T細(xì)胞在抗結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染免疫中發(fā)揮重要作用。人γδ T細(xì)胞受體（TCRγδ）主要由Vγ9和Vδ2組成，在健康人外周血γδT細(xì)胞中約80％為Vγ9δ2T細(xì)胞，對(duì)Mtb抗原的刺激具有顯著增殖反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核?。═B）患者的外周Vγ9δ2T細(xì)胞數(shù)量和對(duì)Mtb抗原刺激的增殖活性均有明顯降低。但是這類Vγ9δ2T細(xì)胞亞群在抗原識(shí)別以及克隆特征方

2、面在TB患者和健康人之間有何不同，至今了解尚不完全。鑒于TCRγδ的γ或δ鏈V區(qū)的互補(bǔ)決定簇區(qū)3（CDR3）是識(shí)別抗原表位的關(guān)鍵位點(diǎn)，而目前對(duì)于TCRγδ所識(shí)別的Mtb抗原多肽表位也不完全清楚。因此從檢測和分析TB患者γδT細(xì)胞Vδ-CDR3基因譜型和序列特征，有助于理解γδT細(xì)胞在抗原識(shí)別方面的克隆特征。另外根據(jù)TB患者的優(yōu)勢(shì)CDR3片段序列合成的肽片段，從噬菌體多肽展示庫中篩選出Mtb相關(guān)性性的抗原表位。將有助于揭示γδT細(xì)胞識(shí)別M

3、tb抗原表位的機(jī)制，為Mtb感染的診斷和防治提供新的方法。
　　目的：檢測和分析活動(dòng)性肺TB患者外周血γδT細(xì)胞受體Vδ2鏈CDR3片段基因譜型和序列特征，應(yīng)用Vδ2-CDR3優(yōu)勢(shì)片段序列合成肽在噬菌體多肽展示庫中篩選Mtb抗原相關(guān)的多肽表位，并對(duì)合成的Mtb抗原多肽表位的激活人γδT細(xì)胞活性進(jìn)行初步鑒定。為闡明TB患者的T細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制以及免疫診斷和治療研究提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　方法：1.采集肺TB患者（n=27）和健

4、康人（n=25）外周血分離PBMC提取RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增TCRγδ的Vδ2基因CDR3片段，PCR產(chǎn)物通過基因掃描分析CDR3片段長度的多樣性變化。
　　2. Vδ2-CDR3的PCR產(chǎn)物純化后連接PMD18-T載體重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化及陽性篩選后用菌落PCR法對(duì)重組陽性質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并對(duì)陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因掃描分析確定其CDR3長度；
　　3.對(duì) Vδ2-CDR3的PCR產(chǎn)物基因掃描優(yōu)勢(shì)峰對(duì)應(yīng)的大部分重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

5、化陽性克隆，以及部分非優(yōu)勢(shì)峰對(duì)應(yīng)克隆的CDR3基因片段，測定DNA序列，并分析和比較其編碼氨基酸的特征。
　　4.從TB患者新鮮PBMC和正常人PBMC經(jīng)Mtb耐熱性抗原刺激增殖的T細(xì)胞擴(kuò)增Vδ2-CDR3的最優(yōu)勢(shì)序列，合成多肽片段包被平板，加噬菌體7肽庫溫育后，先洗去未結(jié)合的噬菌體，然后洗脫并收獲特異結(jié)合的噬菌體擴(kuò)增。經(jīng)3-4輪結(jié)合-淘選-擴(kuò)增循環(huán)，富集特異性結(jié)合噬菌體,并經(jīng)過DNA測序分析和ELISA驗(yàn)證陽性噬菌體，通過BLA

6、ST生物信息學(xué)分析和比對(duì)噬菌體展示多肽序列與Mtb抗原的相關(guān)性。
　　5.從特異性富集噬菌體的多肽序列中尋找到的與Mtb相關(guān)的肽表位序列，合成7肽片段后作為抗原刺激正常人和TB患者的外周血PBMC，用流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞的增殖活性。
　　結(jié)果：1、對(duì)PBMC中TCRγδ的Vδ2-CDR3片段基因掃描結(jié)果顯示：TB患者組（n＝27）優(yōu)勢(shì)峰占總峰的比率(0.2755±0.0619)較正常人組（n=25）（0.1979±0.0

7、346）高，TB患者組的長度變化范圍為（25.11±5.52）較正常人為（19.87±3.52）高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.0和p<0.0）。
　　2、 TB患者TCRγδ的Vδ2-CDR3的片段數(shù)和最優(yōu)勢(shì)峰長度，與正常人比較無顯著變化。
　　3、基因掃描分析顯示CDR3轉(zhuǎn)化陽性菌落PCR峰與CDR3的RT-PCR產(chǎn)物中的掃描峰有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系；有意義的是最高頻率菌落（占40％）的CDR3片段長度與PBMC的RT-PCR

8、產(chǎn)物的基因掃描優(yōu)勢(shì)峰長度完全相同。
　　4、對(duì)CDR3轉(zhuǎn)化的克?。?3個(gè)）的測序結(jié)果表明：TCR Vδ2–CDR3序列均由兩端保守的側(cè)翼序列和中間的多變序列組成；兩端保守的側(cè)翼序列由位于 N端的“CACD”和位于C端的“KLIFGKG”組成，多變的中間序列97號(hào)位均含有疏水性氨基酸殘基。該其中TB患者優(yōu)勢(shì)取用DJ3片段。每位TB患者有自己的優(yōu)勢(shì)序列，患者間偶發(fā)現(xiàn)有共有序列。
　　5、從TB患者新鮮PBMC中Vδ2-CDR3的

9、優(yōu)勢(shì)序列挑選2個(gè)，和從正常人PBMC經(jīng)Mtb耐熱性抗原刺激增殖的T細(xì)胞中Vδ2-CDR3序列挑選2個(gè)，合成的4條多肽片段與噬菌體七肽庫經(jīng)4輪淘選后，得到特異性結(jié)合的噬菌體多肽序列47條，選擇其中最富集序列和有交叉序列的9條，經(jīng)GenBank BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)有4條7肽序列與某些Mtb抗原的序列高度重合。
　　6、從4條與Mtb抗原相關(guān)性的噬菌體多肽序列挑選2條合成7肽片段，用于體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)某些正常人和TB患者個(gè)體的

10、γδT細(xì)胞有刺激增殖活性。
　　結(jié)論：
　　1. TB患者外周血γδT細(xì)胞中Vδ2 CDR3片段優(yōu)勢(shì)峰所占總峰比率比正常人的高，表明正常人γδ T細(xì)胞受體呈高斯分布，具有多克隆特點(diǎn)，而TB患者的顯示寡克隆特點(diǎn)，提示TB患者的γδT細(xì)胞經(jīng)歷了抗原特異性增殖。
　　2 TCRδ2基因CDR3片段中間的多變序列含有疏水性氨基酸殘基，推測其與抗原肽結(jié)合的親和力有關(guān)。TB患者大多優(yōu)勢(shì)取用DJ3片段，提示其與Mtb抗原的特異性識(shí)別

11、可能有關(guān)。
　　3.與健康人外周γδT細(xì)胞經(jīng)Mtb耐熱抗原擴(kuò)增后的Vδ2 CDR3優(yōu)勢(shì)片段具有相同序列比較，TB患者的外周新鮮血γδT細(xì)胞的Vδ2 CDR3片段優(yōu)勢(shì)峰中序列呈多樣化，提示不同TB患者的γδT細(xì)胞的不同克隆參與對(duì)Mtb抗原的免疫應(yīng)答。
　　4、本研究鑒定了4個(gè)TB患者特異性γδT細(xì)胞Vδ2-CDR3序列，經(jīng)噬菌體七肽庫篩選獲得4條Mtb相關(guān)的抗原肽表位，并選擇其中2條合成7肽片段，初步證實(shí)對(duì)正常人和TB患者的γ