含結核特異CDR3保守序列TCR基因的構建及其修飾T細胞抗結核活性研究.pdf

1、目的：
　　找到結核特異CDR3保守序列，構建含保守序列的TCR，研究其修飾患者T細胞的體外抗結核活性，為下一步動物實驗奠定基礎，為含結核特異CDR3保守序列的TCR基因修飾T細胞應用于結核患者群體化過繼免疫治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過CDR3譜型分析找到結核特異CDR3保守序列
　?、俨捎昧馨图毎蛛x液分離結核患者和健康志愿者外周血單個核細胞(PBMC);②分別磁珠分選出CD4+、CD8+T細胞，提

2、取CD4+和CD8+T細胞mRNA，逆轉錄為cDNA;③CDR3譜型分析檢測CDR3譜型，并選擇在CD4+、CD8+T細胞中，呈單克隆擴增的抗原特異TCRα、β基因家族測序分析，分析病例間結核特異CDR3保守序列及優(yōu)勢表達的V基因家族、J基因片段;④利用CDR3譜型復雜性評分系統(tǒng)對結核患者和健康志愿者進行評分，并比較差異;⑤利用相對復雜性評分系統(tǒng)分析結核患者間CDR3區(qū)基因多樣性差異。
　　2.構建含結核特異CDR3保守序列TCR

3、基因的重組逆轉錄病毒表達載體
　?、佾@取高頻使用V基因片段，以及C基因片段的序列，構建含CDR3保守序列的TCR，對其進行構象預測，分析TCRα鏈和β鏈排列組合而成的異二聚體結構的穩(wěn)定性，確定需構建的TCR基因;②根據(jù)人α鏈和β鏈基因家族可變區(qū)(variableregion，V)和恒定區(qū)(constant region，C)基因序列設計引物，擴增含結核特異CDR3保守序列的TCR的α鏈和β鏈全長基因;③采用本實驗室已經(jīng)構建好的最小

4、突變C區(qū)（其中C區(qū)9個氨基酸位點替換）替換α鏈和β鏈全長基因的C區(qū);④利用重組PCR技術，將已最小突變TCRα鏈和β鏈基因通過自剪切多肽2A連接，并克隆至pGEM-T載體測序鑒定;⑤將測序正確的TCR全長基因插入逆轉錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定;⑥采用磷酸鈣轉染法，包裝逆轉錄病毒，超速離心法濃縮病毒;⑦重組病毒轉染NIH3T3細胞，流式細胞術測定感染性滴度，計算公式:病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3細胞總數(shù)×GF

5、P陽性率/病毒濃縮液量(ml)。
　　3.含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾T細胞的抗結核活性
　　IL-2和抗CD3單抗活化T細胞后，以MOI=10將重組病毒pMX-β-2A-α-IRES-GFP轉染T細胞，通過流式細胞術檢測GFP陽性細胞百分比。按一定效靶比（effector∶target，E∶T），將TCR基因修飾T細胞與負載滅活H37Rv菌株的DC混合培養(yǎng)，以未轉染和空載體轉染的T細胞為陰性對照，以雞卵白蛋白(

6、ovalbumin，OVA)為非特異性抗原對照;酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測一定時間TCR基因修飾CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IFNγ、TNF-α、IL-4分泌水平，利用WST-8法檢測TCR基因修飾CD4+T細胞的增殖;ELISA檢測一定時間TCR基因修飾CD8+T細胞培養(yǎng)上清中IFNγ、TNF-α、GrB分泌水平，利用時間分辨熒光免疫分析技術(TRFIA)技術，檢測TCR基因修飾CD8+T細胞對負載MTB的DC的殺傷活性。

7、>　　結果：
　　1.通過CDR3譜型分析找到結核特異CDR3保守序列
　　檢測86例結核患者CDR3譜型，對單克隆增生T細胞進行TCR基因測序，結果顯示:86例病例中V基因片段高頻使用Vα7(43.02％)、Vα9(48.84％)、Vα17(50％)、Vα32(41.86％)、Vβ19(86.5％)、Vβ24(62.79％)基因家族。分析其CDR3區(qū)基因序列，結果顯示:J基因片段中Jα34，Jα57，Jβ2-1出現(xiàn)頻率較高

8、;Vα鏈和Vβ鏈CDR3區(qū)存在保守序列，其中TCR Vα鏈CDR3區(qū)中存在GGGGNKLI、GGGNEQYF、APDTGSGAF保守序歹，TCR Vβ鏈中存在GGGNKLI、TNKLI、SADKLI保守序列。
　　2.構建含結核特異CDR3保守序列TCR基因的逆轉錄病毒表達載體
　　從GeneBank中獲取高頻使用V、J基因片段、以及C基因片段的序列，將CDR3保守序列與V、J、C基因片段拼接成全長α、β鏈基因序列，并對α、

9、β鏈隨機搭配組合形成的TCR進行構象預測，選出穩(wěn)定性較佳的TCR Vβ19、Vα7雙鏈。成功擴增出經(jīng)最小突變的含有結核特異CDR3保守序列的TCRβ及α鏈全長基因，經(jīng)TA克隆后測序，Vβ19、Vα7基因序列與預期的V區(qū)序列完全一致，C區(qū)的基因序列與預期相符。利用自剪切多肽2A，通過重組PCR，擴增出T細胞的hVβ19mCβ-2A-hVα7mC融合基因，將其插入pMX-IRES-GFP，構建重組逆轉錄病毒表達載體pMX-hVβ19mCβ-

10、2A-hVα7mCα-IRES-GFP，酶切鑒定證實基因片段插入正確。將其與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉染包裝細胞GP2-293，48h后取病毒上清，濃縮純化后感染NIH3T3細胞，檢測病毒感染滴度。
　　3.檢測含CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細胞的抗結核活性
　?、贆z測TCR基因修飾CD4+T細胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌
　　按E∶T=7，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細

11、胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)18h，ELISA檢測上清中IFN-γ的分泌水平。結果顯示，患者1的Td+MTB組IFN-γ分泌水平顯著高于UnTd+DC組(P＜0.001)，略高于另外三組但差異不顯著;患者2的Td+MTB組IFN-γ分泌水平顯著高于其他各組(P＜0.05)。
　　按E∶T=20，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測上清中TNF-α的分泌水平

12、。結果顯示，2例患者Td+MTB組的TNF-α分泌水平均顯著高于其他各組(P＜0.001)。
　　按E∶T=15，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測上清中IL-4的分泌水平。結果顯示，患者1的Td+MTB組IL-4分泌水平顯著低于UnTd+DC組、EmTd+MTB組和Td+OVA組(P＜0.001)，略低于UnTd+MTB組但差異不顯著;患者2的Td+MTB

13、組IL-4分泌水平顯著低于其他各組(P＜0.05)。
　?、跈z測TCR基因修飾CD4+T細胞的增殖
　　按E∶T=7，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)，測定第7天各組CD4+T細胞的增殖水平。結果顯示，患者1的Td+MTB組增殖水平顯著高于UnTd+DC組和UnTd+MTB組(P＜0.05)，略高于其它兩組但差異不顯著;患者2各組間增殖水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但

14、Td+MTB組T細胞增殖水平略高于其它各組。
　　4.檢測含CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細胞的抗結核活性
　　①檢測TCR基因修飾CD8+T細胞的IFN-γ、 TNF-α、GrB分泌
　　按E∶T=7，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)18h，ELISA檢測上清中IFN-γ的分泌水平。結果顯示，患者1的Td+MTB組IFN-γ分泌水平顯著高于Td+OVA組

15、(P＜0.05)，略高于其它三組但差異不顯著;患者2的Td+MTB組IFN-γ分泌水平顯著高于其他各組(P＜0.05)。
　　按E∶T=20，將含保守CDR3序列TCR基因修飾CD8+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測上清中TNF-α的分泌水平。結果顯示，患者1的Td+MTB組TNF-α分泌水平顯著高于UnTd+DC組、UnTd+MTB組和Td+OVA組(P＜0.05)，略高于EmTd+MTB組但差異不顯著

16、;患者2的Td+MTB組TNF-α分泌水平顯著高于其他各組(P＜0.05)。
　　按E∶T=20，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測上清中GrB的分泌水平。結果顯示，患者1的Td+MTB組GrB分泌水平顯著高于其他各組(P＜0.001);患者2的Td+MTB組GrB分泌水平顯著高于UnTd+DC組、UnTd+MTB組和Td+OVA組(P＜0.05)，略高于E

17、mTd+MTB組但差異不顯著。
　　②檢測TCR基因修飾CD8+T細胞的殺傷活性
　　按E∶T=30，將含結核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細胞和負載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)，檢測各組CD8+T細胞對靶細胞的殺傷作用。結果顯示，患者1的Td+MTB組的殺傷率顯著高于UnTd+DC組、UnTd+MTB組和EmTd+MTB組(P＜0.05)，略高于Td+OVA組但差異不顯著;患者2的Td+MTB組的殺傷率顯著高于其

18、他各組(P＜0.05)。
　　結論：
　　在本研究中，通過CDR3譜型分析，找到86例結核初治患者中保守的CDR3序列，從GeneBank中獲取高頻使用V基因、J基因片段，以及C基因片段的序列，首次構建含CDR3保守序列的TCR，對其進行構象預測，進而構建了其重組逆轉錄病毒表達載體，制備重組逆轉錄病毒，轉染2例結核患者CD4+和CD8+T細胞，證實其具有一定的體外抗結核活性，為含結核特異CDR3保守序列的TCR基因修飾T細胞