γδT細(xì)胞抗原識(shí)別機(jī)制研究：熱休克蛋白的直接識(shí)別以及HBV-TCR CDR3δ多肽結(jié)合特性和結(jié)合多肽的篩選.pdf

1、γδT細(xì)胞兼具特異性和非特異性免疫應(yīng)答雙重特征，其在機(jī)體免疫應(yīng)答中所處的進(jìn)化地位和生物學(xué)意義與功能有待于進(jìn)一步闡明。因此，揭示γδ抗原識(shí)別受體(TCR)抗原識(shí)別的規(guī)律，將有助于對(duì)上述理論問(wèn)題進(jìn)行澄清，并可為免疫學(xué)應(yīng)用提供新的策略與手段。 本論文旨在研究γδT細(xì)胞對(duì)熱休克蛋白(HSP)的識(shí)別機(jī)制和探討乙型肝炎病毒感染患者TCRVδ2的抗原識(shí)別機(jī)理，以及以TCRCDR3δ為探針篩選和鑒定γδTCR識(shí)別的表位多肽。 (一)人類

2、γδT細(xì)胞對(duì)細(xì)胞表面熱休克蛋白(membraneHSPs)識(shí)別機(jī)制的研究熱休克蛋白在免疫應(yīng)答中主要作用包括：1)與表位肽形成HSPs-peptide復(fù)合物，表達(dá)在細(xì)胞表面，參與抗原提呈過(guò)程；2)作為靶分子直接為免疫細(xì)胞所識(shí)別，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。針對(duì)上述問(wèn)題，本文首先重點(diǎn)研究了在γδT細(xì)胞識(shí)別HSP分子的過(guò)程中，HSP分子究竟是作為抗原提呈分子還是作為抗原這一基本問(wèn)題，繼而初步探討了HSP分子和γδT細(xì)胞相互作用的生物學(xué)意義。為此，首先我

3、們以EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞(LCL細(xì)胞)作為細(xì)胞模型，探討了細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一應(yīng)激事件對(duì)細(xì)胞膜表面HSP分子表達(dá)水平的影響；其次應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，分別敲除HSP60和HSP70分子，觀察LCL細(xì)胞上述基因表達(dá)水平與γδT細(xì)胞對(duì)LCL細(xì)胞毒活性間的相關(guān)性；最后，利用體外增殖實(shí)驗(yàn)，探討HSP分子是否對(duì)γδT細(xì)胞具有直接刺激作用。研究結(jié)果顯示，在LCL細(xì)胞表面，HSP60和HSP70分子均可在轉(zhuǎn)化應(yīng)激的誘導(dǎo)下表達(dá)增高。HSP70分子

4、表達(dá)下調(diào)后，γδT細(xì)胞對(duì)自體和異體來(lái)源的LCL細(xì)胞毒活性均受到抑制，與對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而HSP60分子表達(dá)水平對(duì)γδT細(xì)胞殺傷活性的影響較小。[3H]-TdR摻入實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HSP72分子可以直接刺激γδT細(xì)胞發(fā)生增殖。上述結(jié)果不僅在理論上支持了γδT細(xì)胞通過(guò)直接識(shí)別HSP分子參與早期免疫應(yīng)答，尤其在對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視，同時(shí)也為以HSP70分子(尤其是HSP72分子)為佐劑，輔助γδT細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療提供了依

5、據(jù)。目前，上述結(jié)果所形成的論文已被“ImmunologicalInvestigations”接收。 (一)HBV慢性感染患者TCRVδ2抗原識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與相應(yīng)抗原識(shí)別表位多肽的篩選與鑒定 其具體研究?jī)?nèi)容為：γδTCR中δ鏈的CDR3區(qū)在抗原識(shí)別中的作用，并分析其中的關(guān)鍵序列；然后利用人工合成的CDR3δ多肽在噬菌體肽庫(kù)篩選相應(yīng)的抗原表位多肽。 我們首先選擇慢性HBV慢性感染(CHB)患者作為研究對(duì)象，通過(guò)RT-

6、PCR，從CHB患者外周血的γδT細(xì)胞中，擴(kuò)增其抗原識(shí)別受體(γδTCR)V區(qū)并進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)與GenBank現(xiàn)有序列對(duì)比進(jìn)行分析，了解CHB患者外周血γδTCRV區(qū)序列特征。結(jié)果提示CHB患者TCRVδ2CDR3長(zhǎng)度保守；基因組成以V1D3J1為主，其中D3片段讀碼框優(yōu)勢(shì)取用“LGDT”；而在N/P位點(diǎn)中，F(xiàn)-7位中性氨基酸(GAVLI)的取用少于對(duì)照組。 其次，我們利用人工合成CHB患者來(lái)源的CDR3δ肽，研究其與HBV感染

7、肝組織或者HBV感染肝細(xì)胞模型的結(jié)合特異性。結(jié)果表明，含有保守序列的CDR3δ合成肽(CH1)可以與HBV感染肝組織以及HBV感染肝細(xì)胞模型2.2.15細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，而與正常肝組織則無(wú)結(jié)合反應(yīng)。為進(jìn)一步研究組成CDR3δ的各基因片段的編碼產(chǎn)物(V、D和J片段)在抗原識(shí)別中的作用，我們合成了用隨機(jī)序列替換上述片段的對(duì)照肽Vm、Dm、Jm和VJm。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡分析和SPR技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)Vm和VJm突變肽幾乎不與2.2.15細(xì)胞

8、結(jié)合，而Dm和Jm與2.2.15細(xì)胞的結(jié)合水平與CH1基本相當(dāng)。這一結(jié)果提示CDR3δ的側(cè)翼序列在抗原識(shí)別中起決定性作用。 最后，我們以CDR3δ合成肽為探針，在噬菌體展示肽庫(kù)(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibrary)中進(jìn)行了抗原表位多肽的篩選，獲得了八條特異結(jié)合的肽片段。經(jīng)過(guò)ELISA驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析，選擇合成了其中兩條進(jìn)行了初步的功能研究。這兩條多肽的序列分別為“WHWTNWGKTSPA