連環(huán)素p120調(diào)控NF-κB活化在氣道炎癥反應(yīng)中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 脂多糖誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)中連環(huán)素p120對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響
　　目的:本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（LPS）刺激體外培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞建立氣道上皮炎癥反應(yīng)模型，檢測連環(huán)素p120（簡稱p120）蛋白的表達(dá)變化、NF-κB信號(hào)通路的活化及其下游靶基因IL-8的表達(dá)變化，初步探討人體氣道炎癥發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法:根據(jù)MTT結(jié)果及本實(shí)驗(yàn)室前期研究，選取20μg/ml LPS

2、作為致炎因子處理培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞；運(yùn)用免疫熒光、細(xì)胞核漿分離提取蛋白及Western blot技術(shù)檢測刺激前后p120、抑制蛋白IκBα及NF-κB亞基p65蛋白表達(dá)的改變及p65是否發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位；運(yùn)用ELISA和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測IL-8表達(dá)量的改變；運(yùn)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及特異性siRNA技術(shù)以增強(qiáng)或敲低細(xì)胞中p120的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證p120與NF-κB信號(hào)通路之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:Ⅰ．Western blot、熒光

3、實(shí)時(shí)定量PCR及免疫熒光染色證實(shí)p120存在于人氣道上皮細(xì)胞中，而且，與對(duì)照組比較，LPS刺激后p120蛋白表達(dá)下調(diào)。
　?、颍?xì)胞核漿分離提蛋白及Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LPS刺激人氣道上皮細(xì)胞后，NF-κB信號(hào)通路活化——NF-κB p65總蛋白表達(dá)增多，而且轉(zhuǎn)位入核，其抑制蛋白IκBα表達(dá)逐漸減少。同時(shí)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA顯示NF-κB下游的靶基因IL-8的表達(dá)量較未給予LPS刺激的對(duì)照組明顯增多，差

4、異具有顯著性。
　?、螅庠葱愿弑磉_(dá)p120及siRNA技術(shù)使細(xì)胞中p120低表達(dá)后，進(jìn)一步驗(yàn)證p120與NF-κB信號(hào)通路之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性p120過表達(dá)后，NF-κB p65總蛋白量幾乎無改變，p65未發(fā)生核轉(zhuǎn)位，IL-8的表達(dá)水平變化不大。然而，LPS刺激后，過表達(dá)組IL-8表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P<0.001）。p120敲低后NF-κB信號(hào)通路顯著活化——NF-κB p65總蛋白表達(dá)增多，p65轉(zhuǎn)位入核， I

5、L-8表達(dá)水平增加（P<0.001）。進(jìn)一步證明LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)中，p120可能通過負(fù)性調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論:LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)中，p120蛋白表達(dá)下調(diào)，NF-κB信號(hào)通路活化；過表達(dá)p120可抑制NF-κB信號(hào)通路，敲低p120后NF-κB信號(hào)通路顯著活化。LPS刺激可能通過下調(diào)p120進(jìn)而活化NF-κB信號(hào)通路引起氣道上皮的炎癥反應(yīng)。
　　第二部分 氣道炎癥中p120調(diào)控的NF-κ

6、B活化部分依賴RhoGTP酶家族蛋白R(shí)hoA
　　目的:本實(shí)驗(yàn)通過LPS刺激及機(jī)械劃傷建立體外培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，檢測RhoGTP酶家族蛋白R(shí)hoA活性變化及其與p120、NF-κB之間的關(guān)系，探討氣道炎癥中p120調(diào)控NF-κB信號(hào)通路活化的可能分子機(jī)制。
　　方法:運(yùn)用免疫共沉淀及Western blot方法檢測刺激前后RhoA總蛋白表達(dá)改變及其與p120的結(jié)合情況；運(yùn)用G-LISA方法檢測RhoA活性變化

7、；采用RhoA下游ROCK抑制劑Y26732抑制RhoA活性后，通過細(xì)胞核漿分離提取蛋白及Western blot檢測NF-κB的活性變化；使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源性p120質(zhì)粒及特異性siRNA技術(shù)干預(yù)p120表達(dá)，進(jìn)一步觀測氣道上皮細(xì)胞中RhoA活性變化及其與p120、NF-κB之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:Ⅰ．免疫共沉淀結(jié)果首次顯示氣道上皮細(xì)胞中RhoA與p120相互作用并存在于同一復(fù)合物中。
　?、颍甃PS刺激和機(jī)械劃傷方法處理氣

8、道上皮細(xì)胞后，Western blot及免疫共沉淀結(jié)果顯示 RhoA總蛋白以及與p120結(jié)合的RhoA蛋白改變不明顯，但G-LISA檢測發(fā)現(xiàn)RhoA活性顯著上升。
　?、螅\(yùn)用抑制劑Y27632抑制RhoA活性后，細(xì)胞核漿分離提取蛋白及Western blot結(jié)果顯示氣道炎癥反應(yīng)中NF-κB p65亞基的入核被部分抑制。
　?、簦畃120過表達(dá)后，與對(duì)照組相比，盡管RhoA活性無變化，但LPS刺激后，p120過表達(dá)組RhoA

9、活性明顯下降（P<0.001）；同樣，機(jī)械劃傷刺激后，p120 N過表達(dá)組RhoA活性明顯下降（P<0.05），同時(shí)，IL-8表達(dá)下調(diào)。
　　Ⅴ．siRNA敲低p120后，RhoA總蛋白無變化，與p120結(jié)合的RhoA隨著p120表達(dá)缺失而無法檢測。G-LISA檢測發(fā)現(xiàn)RhoA活性顯著上升，LPS刺激和機(jī)械劃傷后，RhoA活性升高更為顯著（P<0.001及P<0.05）。同時(shí)，機(jī)械劃傷后IL-8表達(dá)增加，差異具有顯著性。
　

10、　結(jié)論:Ⅰ．氣道上皮細(xì)胞中，RhoA與p120存在于同一復(fù)合物中。氣道炎癥反應(yīng)中，雖然RhoA總蛋白以及和p120結(jié)合的RhoA蛋白無變化，但RhoA活化。
　?、颍种苿℡27632抑制RhoA活性后，NF-κB活化被部分抑制。
　　Ⅲ．p120過表達(dá)不活化RhoA，但p120敲低后RhoA活性顯著上升，伴隨NF-κB p65亞基轉(zhuǎn)位入核及IL-8表達(dá)水平增加。
　　經(jīng)推測，氣道炎癥反應(yīng)中p120可能部分通過RhoA