HIWI影響肝細胞癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機制及其預(yù)后價值的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要是肝細胞癌（以下簡稱肝癌），其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第五位，而腫瘤致死率則位居全球第三。目前，外科根治性切除是治療肝癌的主要方法，但其術(shù)后高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是阻礙肝癌患者獲得長期生存的主要問題。因此探索新的有效生物指標來進行預(yù)后判斷或者作為靶點發(fā)展新的輔助治療手段，成為預(yù)防及治療肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要研究方向。
　　越來越多的研究已經(jīng)顯示微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以通過RNA干擾（RNA in

2、terference，RNAi）途徑調(diào)節(jié)很多細胞內(nèi)的基因表達。其中有半數(shù)miRNAs位于較為脆弱的染色質(zhì)位點以及那些經(jīng)常在各種腫瘤內(nèi)功能丟失或功能放大的區(qū)域，提示了這些miRNAs可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，他們也被稱為腫瘤miRNAs（oncomiRs）。然而，雖然在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中抑制這些oncomiRs可以成為一種新型有效的腫瘤療法，但由于每種oncomiR對于腫瘤發(fā)展所起的作用是各自獨立的，因此在腫瘤細胞中同時抑制多種on

3、comiR是極為困難的。而PIWI亞家族是Argonaute蛋白家族的兩個亞家族（AGO和PIWI）之一，是RNAi機制的必需組成蛋白，同時也可以調(diào)節(jié)大多miRNAs的生物合成。這些蛋白出現(xiàn)在已被報道的所有RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplexes，RISC)中，并且被認為是在成熟miRNAs生物合成過程中的必需蛋白。HIWI（又稱PIWIL1）主要在人類的生殖細胞中表達，其與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和

4、預(yù)后的聯(lián)系已經(jīng)在近期多個研究中被報道。然而，在肝癌研究中僅有有限的關(guān)于HIWI的數(shù)據(jù)被報道且并未得出任何結(jié)論。因而，相比較單個miRNAs而言，探索HIWI和肝癌之間的聯(lián)系可能是尋找肝癌有效預(yù)后指標和治療靶點的一個更有希望的途徑。因此我們對其進行了系統(tǒng)研究。
　　我們利用RT-PCR和Western Blot方法檢測人不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞株HepG2、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H及HCCLM3和人正常肝細胞株L

5、02內(nèi)的HIWI表達情況，同時利用RT-PCR方法檢測其在冰凍肝癌標本及相應(yīng)癌旁組織標本(n=20)內(nèi)的表達情況，發(fā)現(xiàn)HIWI的表達在L02細胞株、低轉(zhuǎn)移潛能細胞株和中高轉(zhuǎn)移潛能細胞株中逐級增加(P=0.039)，并且在肝癌組織內(nèi)的表達顯著高于其相應(yīng)的癌旁組織(P＜0.001)。
　　為進一步探索HIWI在肝癌中所起的作用以及其可能的內(nèi)在機制，我們設(shè)計并合成不同抑制效率的HIWI靶向siRNA: control siRNA、HIW

6、I-970和HIWI-1510，并將它們轉(zhuǎn)染入HCCLM3、MHCC97H和MHCC97L三種肝癌細胞株。在siRNA轉(zhuǎn)入24 h后，RT-PCR和Western Blot檢測證實細胞內(nèi)HIWI表達的抑制效率隨control siRNA、HIWI-970和HIWI-1510表現(xiàn)出顯著提高的趨勢，且三者之間有顯著差異（P＜0.001）。HIWI的下調(diào)造成細胞增殖功能在轉(zhuǎn)染siRNA72 h后出現(xiàn)顯著抑制(P＜0.001)。同樣，在Tran

7、swell小室侵襲實驗中，抑制HIWI表達也造成了腫瘤細胞侵襲能力的顯著下降(P＜0.001)。且在該三種細胞株功能實驗中，細胞增殖與侵襲能力的抑制隨著control siRNA、HIWI-970和HIWI-1510表現(xiàn)出顯著提高趨勢。
　　基于前期結(jié)果，我們構(gòu)建了肝癌組織芯片(n=168)，利用免疫組織化學(xué)方法進行HIWI染色，探索HIWI與臨床病理特征的相關(guān)性及其表達的預(yù)后價值。結(jié)果顯示HIWI在肝癌組織及其癌旁組織的胞質(zhì)、胞

8、膜和胞核中均有染色。其在腫瘤組織中的表達陽性率為26.19％高于癌旁組織的2.98％(P＜0.001)。腫瘤組織內(nèi)HIWI陽性染色的患者與腫瘤體積大(P=0.047)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶多(P=0.027)和淋巴轉(zhuǎn)移率高(P=0.004)等臨床病理特征呈正相關(guān)。PCNA主要在肝癌組織及其癌旁組織的胞核染色。在HIWI陽性表達的肝癌組織中，PCNA表達陽性率為97.73％，在HIWI陰性肝癌組織中PCNA陽性率為66.13％，兩者呈正相關(guān)(P＜0

9、.001)。腫瘤組織內(nèi)HIWI的表達是肝癌患者總體生存(P=0.007)與無瘤生存(P=0.036)的獨立危險因素，其總生存時間和無瘤生存時間預(yù)測價值在AFP≤300 ng/ml（P=0.002和P＜0.001）和Edmondson-SteinerⅠ-Ⅱ級（P=0.038和P=0.022）的條件下依然存在;但在AFP＞300 ng/ml（P=0.463和P=0.987）和Edmondson-SteinerⅢ-Ⅳ級（P=0.331和P=0