HIWI影響肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制及其預(yù)后價(jià)值的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要是肝細(xì)胞癌（以下簡稱肝癌），其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第五位，而腫瘤致死率則位居全球第三。目前，外科根治性切除是治療肝癌的主要方法，但其術(shù)后高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是阻礙肝癌患者獲得長期生存的主要問題。因此探索新的有效生物指標(biāo)來進(jìn)行預(yù)后判斷或者作為靶點(diǎn)發(fā)展新的輔助治療手段，成為預(yù)防及治療肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要研究方向。
　　越來越多的研究已經(jīng)顯示微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以通過RNA干擾（RNA in

2、terference，RNAi）途徑調(diào)節(jié)很多細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。其中有半數(shù)miRNAs位于較為脆弱的染色質(zhì)位點(diǎn)以及那些經(jīng)常在各種腫瘤內(nèi)功能丟失或功能放大的區(qū)域，提示了這些miRNAs可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，他們也被稱為腫瘤miRNAs（oncomiRs）。然而，雖然在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中抑制這些oncomiRs可以成為一種新型有效的腫瘤療法，但由于每種oncomiR對(duì)于腫瘤發(fā)展所起的作用是各自獨(dú)立的，因此在腫瘤細(xì)胞中同時(shí)抑制多種on

3、comiR是極為困難的。而PIWI亞家族是Argonaute蛋白家族的兩個(gè)亞家族（AGO和PIWI）之一，是RNAi機(jī)制的必需組成蛋白，同時(shí)也可以調(diào)節(jié)大多miRNAs的生物合成。這些蛋白出現(xiàn)在已被報(bào)道的所有RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplexes，RISC)中，并且被認(rèn)為是在成熟miRNAs生物合成過程中的必需蛋白。HIWI（又稱PIWIL1）主要在人類的生殖細(xì)胞中表達(dá)，其與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和

4、預(yù)后的聯(lián)系已經(jīng)在近期多個(gè)研究中被報(bào)道。然而，在肝癌研究中僅有有限的關(guān)于HIWI的數(shù)據(jù)被報(bào)道且并未得出任何結(jié)論。因而，相比較單個(gè)miRNAs而言，探索HIWI和肝癌之間的聯(lián)系可能是尋找肝癌有效預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的一個(gè)更有希望的途徑。因此我們對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　我們利用RT-PCR和Western Blot方法檢測人不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H及HCCLM3和人正常肝細(xì)胞株L

5、02內(nèi)的HIWI表達(dá)情況，同時(shí)利用RT-PCR方法檢測其在冰凍肝癌標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本(n=20)內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HIWI的表達(dá)在L02細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株和中高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株中逐級(jí)增加(P=0.039)，并且在肝癌組織內(nèi)的表達(dá)顯著高于其相應(yīng)的癌旁組織(P＜0.001)。
　　為進(jìn)一步探索HIWI在肝癌中所起的作用以及其可能的內(nèi)在機(jī)制，我們設(shè)計(jì)并合成不同抑制效率的HIWI靶向siRNA: control siRNA、HIW

6、I-970和HIWI-1510，并將它們轉(zhuǎn)染入HCCLM3、MHCC97H和MHCC97L三種肝癌細(xì)胞株。在siRNA轉(zhuǎn)入24 h后，RT-PCR和Western Blot檢測證實(shí)細(xì)胞內(nèi)HIWI表達(dá)的抑制效率隨control siRNA、HIWI-970和HIWI-1510表現(xiàn)出顯著提高的趨勢，且三者之間有顯著差異（P＜0.001）。HIWI的下調(diào)造成細(xì)胞增殖功能在轉(zhuǎn)染siRNA72 h后出現(xiàn)顯著抑制(P＜0.001)。同樣，在Tran

7、swell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中，抑制HIWI表達(dá)也造成了腫瘤細(xì)胞侵襲能力的顯著下降(P＜0.001)。且在該三種細(xì)胞株功能實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞增殖與侵襲能力的抑制隨著control siRNA、HIWI-970和HIWI-1510表現(xiàn)出顯著提高趨勢。
　　基于前期結(jié)果，我們構(gòu)建了肝癌組織芯片(n=168)，利用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行HIWI染色，探索HIWI與臨床病理特征的相關(guān)性及其表達(dá)的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示HIWI在肝癌組織及其癌旁組織的胞質(zhì)、胞

8、膜和胞核中均有染色。其在腫瘤組織中的表達(dá)陽性率為26.19％高于癌旁組織的2.98％(P＜0.001)。腫瘤組織內(nèi)HIWI陽性染色的患者與腫瘤體積大(P=0.047)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶多(P=0.027)和淋巴轉(zhuǎn)移率高(P=0.004)等臨床病理特征呈正相關(guān)。PCNA主要在肝癌組織及其癌旁組織的胞核染色。在HIWI陽性表達(dá)的肝癌組織中，PCNA表達(dá)陽性率為97.73％，在HIWI陰性肝癌組織中PCNA陽性率為66.13％，兩者呈正相關(guān)(P＜0

9、.001)。腫瘤組織內(nèi)HIWI的表達(dá)是肝癌患者總體生存(P=0.007)與無瘤生存(P=0.036)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間預(yù)測價(jià)值在AFP≤300 ng/ml（P=0.002和P＜0.001）和Edmondson-SteinerⅠ-Ⅱ級(jí)（P=0.038和P=0.022）的條件下依然存在;但在AFP＞300 ng/ml（P=0.463和P=0.987）和Edmondson-SteinerⅢ-Ⅳ級(jí)（P=0.331和P=0