缺氧誘導(dǎo)因子α亞基與其羥化酶的相互調(diào)控機(jī)制在缺氧性肺動(dòng)脈高壓形成中的作用.pdf

1、背景:缺氧誘導(dǎo)因子是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)也起十分重要的作用,是使缺氧性肺血管重塑形成中調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的―分子開關(guān)‖。缺氧誘導(dǎo)因子α亞基特定脯氨酸及天冬酰氨殘基羥基化是調(diào)節(jié)其對氧穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵。缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶(PHD1,PHD2, PHD3)使缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α,HIF-α)脯氨酸殘基羥基化并調(diào)節(jié)其對氧穩(wěn)定性。天冬酰氨羥化酶(即缺氧

2、誘導(dǎo)因子抑制因子,FIH)通過氧敏感的方式調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子活性。PHDs也是HIF的靶基因,可以調(diào)控PHDs的轉(zhuǎn)錄。iNOS是HIF的靶基因,而一氧化氮(NO)可通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子羥化酶的活性調(diào)節(jié)HIF-α的表達(dá)。
　　目的:研究大鼠HPH模型和COPD患者肺動(dòng)脈高壓形成過程中PHDs、FIH表達(dá)變化的規(guī)律及與HIF-α間的相互調(diào)控,闡明PHDs、FIH調(diào)控HIF-α在HPH發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。探討NO是否通過影響PHDs、

3、FIH及HIF-α抑制HPH發(fā)生發(fā)展,為尋找HPH治療的新的藥物靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)共分兩部分。第一部分實(shí)驗(yàn)復(fù)制HPH大鼠模型(10％ O2,每天間斷缺氧8小時(shí),共21天),在缺氧0天(對照組)、3天、7天、14天和21天不同時(shí)間點(diǎn),及腹腔注射L-Arg或L-NAME并缺氧21天后,用右心導(dǎo)管法測定大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mPAP),稱量法計(jì)算右心室肥大指數(shù)(RVHI),HE染色進(jìn)行肺小動(dòng)脈重塑(HPVR)指標(biāo)觀察。原位雜

4、交、RT-PCR檢測肺內(nèi)PHD1、PHD2、PHD3,FIH及HIF-α、iNOS的mRNA表達(dá)水平及部位,免疫組化、western blot檢測PHD1、PHD2、PHD3,FIH及HIF-α、iNOS的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及部位。第二部分通過HE染色檢測COPD患者和對照組患者肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變,應(yīng)用原位雜交和免疫組化檢測肺小動(dòng)脈壁內(nèi)PHD1、PHD2、PHD3,FIH及HIF-α、iNOS mRNA的表達(dá)水平,應(yīng)用免疫組化檢測肺小動(dòng)脈壁

5、內(nèi)PHD1、PHD2、PHD3,FIH及HIF-α、iNOS蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)缺氧7d后mPAP開始上升,與對照組比較差異有顯著性( P<0.05),缺氧14 d達(dá)高水平并維持。缺氧14d后出現(xiàn)肺血管重塑和RVHI增加。HIF-1α蛋白在對照組肺內(nèi)表達(dá)不明顯,缺氧3d組表達(dá)均開始升高(P<0.05,與對照組比),缺氧7d達(dá)高峰,14d和21d稍下降。HIF-1α、mRNA在對照組肺動(dòng)脈和肺組織表達(dá)陽性,缺氧14d后

6、表達(dá)略增高(與對照組比較P<0.05)。HIF-2α、HIF-3α蛋白質(zhì)及HIF-3αmRNA缺氧14天達(dá)高峰,缺氧21天保持高水平。HIF-1α、HIF-2αmRNA在對照組肺動(dòng)脈血管壁表達(dá)陽性,缺氧14天后表達(dá)略增高(P<0.05)。對照組PHD1、PHD2 mRNA和蛋白質(zhì)呈陽性表達(dá),PHD3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)不明顯。PHD1mRNA缺氧14d略升高,與對照組比差異無顯著性(P>0.05),PHD2、PHD3 mRNA缺氧3d

7、增高, PHD3 mRNA增高更明顯。PHD1蛋白質(zhì)缺氧14d下降,缺氧21d保持較低水平,PHD3蛋白質(zhì)缺氧3d明顯增高,缺氧7d保持高水平,缺氧14和21d下降。直線相關(guān)分析表明,在缺氧組大鼠中PHD2蛋白質(zhì)與HIF-1α蛋白質(zhì)呈負(fù)相關(guān),PHD1、PHD3蛋白質(zhì)與HIF-2α、HIF-3α蛋白質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。HIF-α蛋白質(zhì)與PHD2、PHD3 mRNA及RVHI、mPAP、WA%、PAMT呈正相關(guān)。
　　(2)缺氧組mPAP、R

8、VHI都增高(P<0.05,與對照組比),并發(fā)生血管重塑。L-Arg組mPAP、RVHI較H組低(P<0.05),血管重塑不如H組明顯,L-NAME組mPAP、RVHI較H組高(P<0.05),血管重塑比H組更明顯。缺氧組HIF-1α、HIF-3αmRNA表達(dá)增高,3個(gè)缺氧組間HIF-1αmRNA表達(dá)差異無顯著性,而L-NAME組HIF-3αmRNA表達(dá)高于L-Arg組(P<0.05),其它組間無差異。L-NAME組HIF-2αmRNA

9、高于對照組,其它組之間差異無顯著性。缺氧組 HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α蛋白質(zhì)表達(dá)均增高(P<0.05),且L-Arg組表達(dá)低于H組(P<0.05),L-NAME組高于H組(P<0.05)。直線相關(guān)分析表明HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α蛋白質(zhì)均與mPAP呈強(qiáng)相關(guān)。
　　(3)COPD患者肺小血管HIF-αmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均增高,蛋白質(zhì)增高更明顯,COPD患者PHD1 mRNA與對照組比較差異無顯著性意義,

10、PHD2、PHD3 mRNA表達(dá)明顯增高,PHD1蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低,PHD2蛋白質(zhì)水平升高,PHD3較對照組比較差異無顯著性。FIH mRNA和蛋白質(zhì)在對照組和COPD組均呈陽性表達(dá),但兩組間比較差異無顯著性意義。
　　結(jié)論:(1)鼠肺動(dòng)脈高壓模型及COPD患者肺小血管中PHDs對HIF-α的調(diào)節(jié)具有相對選擇性。缺氧導(dǎo)致PHDs、FIH表達(dá)及活性降低可能是缺氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病機(jī)制。(2)在大鼠肺動(dòng)脈高壓模