轉(zhuǎn)錄因子KLF5在缺氧性肺動脈高壓中的作用.pdf

1、第一部分轉(zhuǎn)錄因子KLF5在缺氧性肺動脈高壓中的作用
　　目的：缺氧性肺動脈高壓是一種復(fù)雜的系統(tǒng)性疾病，肺小動脈重構(gòu)是其主要的病理特征。KLF5（Krüppel-like factor5）作為一種鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化以及遷移過程。它在肺動脈高壓病人的肺動脈平滑肌細胞中高表達。研究發(fā)現(xiàn)KLF5參與了心血管重構(gòu)的形成過程。然而，目前KLF5在缺氧性肺動脈高壓中的作用及分子機制尚不清楚。
　　方法：實

2、驗采用成年雄性SD大鼠（體重為200-250g），分別置于常氧或缺氧環(huán)境（10％氧濃度）中培養(yǎng)。檢測大鼠血流動力學(xué)指標，評估其肺動脈中膜厚度和右心室肥厚程度，行肺組織HE染色觀測大鼠血管重構(gòu)情況。在常氧或缺氧（5%氧濃度）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺動脈平滑肌細胞（humanpulmonary artery smooth muscle cells，HPASMC）。在HPASMC中行CCK-8、BrdU標記、PI單染、Annexin-V/PI雙染、t

3、ranswell遷移實驗檢測細胞活力、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和細胞遷移能力。行免疫印跡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色實驗檢測目的蛋白水平。行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測目的基因mRNA水平。提取暴露于常氧和缺氧環(huán)境的 HPASMC裂解產(chǎn)物，通過免疫共沉淀實驗明確 KLF5和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）之間是否存

4、在關(guān)聯(lián)。采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)HPASMC中KLF5和HIF-1α的表達。為上調(diào)KLF5水平，建立過表達KLF5基因的慢病毒載體并感染HPASMC。構(gòu)建KLF5基因短發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，通過尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)以下調(diào)KLF5表達。
　　結(jié)果：缺氧組大鼠的平均肺動脈壓力顯著升高，伴隨遠端肺小動脈中膜增厚及右心室肥厚。缺氧引

5、起大鼠肺動脈中膜層PCNA、Ki67陽性細胞增多，TUNEL陽性細胞減少。缺氧HPASMC的增殖和遷移能力增強，細胞凋亡減少。沉默KLF5或HIF-1α可以逆轉(zhuǎn)這些生物學(xué)改變。在平滑肌細胞中，沉默 KLF5后 HIF-1α蛋白水平下調(diào)，過表達KLF5可以上調(diào)HIF-1α水平，而沉默HIF-1α后KLF5表達無顯著改變。免疫共沉淀實驗提示 KLF5和HIF-1α存在直接結(jié)合，缺氧刺激下沉淀的目的蛋白增多。細胞周期蛋白cyclin B1、c

6、yclin D1和凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、survivin、caspase-3和caspase-9參與了KLF5-HIF-1α軸對HPASMC生長的調(diào)控。KLF5沉默大鼠的肺動脈中 HIF-1α表達顯著下調(diào)，平均肺動脈壓和肺動脈重構(gòu)情況顯著改善，與細胞實驗的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：缺氧促進肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移增加，凋亡減少，血管重構(gòu)形成。本研究從細胞水平和在體水平驗證了 KLF5-HIF-1α軸存在于缺氧大鼠的肺動脈平

7、滑肌細胞，并且在缺氧性肺血管重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用。KLF5是缺氧性肺動脈高壓治療的潛在靶點。
　　第二部分轉(zhuǎn)錄因子KLF5在在缺氧對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡中的作用
　　目的：轉(zhuǎn)錄因子KLF5在腫瘤組織中廣泛表達，且是腫瘤的一個預(yù)后因子。然后，KLF5在非小細胞肺癌中的作用尚未闡明。缺氧通過HIF-1α在腫瘤的發(fā)展中起重要作用。本研究旨在探討 KLF5在缺氧性肺癌細胞生長中的作用以及 KLF5和HIF-1α的潛在關(guān)聯(lián)。

8、r>　　方法：我們通過對暴露于常氧（20%氧濃度）或缺氧（1%氧濃度）環(huán)境的 A549細胞進行CCK-8實驗、克隆形成實驗、CFSE標記實驗、Annexin-V/PI實驗檢測細胞的活力、克隆形成能力、增殖和凋亡。通過合成小干擾 RNA來下調(diào) KLF5和HIF-1α的表達。采用PCR和免疫印跡的方法檢測mRNA和蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：研究顯示缺氧可以增強 A549細胞活力、克隆形成能力，促進增殖，抑制細胞凋亡。缺氧上調(diào)HIF-

9、1α和KLF5的表達，呈時間依賴性。沉默KLF5和HIF-1α可以通過下調(diào)cyclin B1、survivin，上調(diào)caspase-3逆轉(zhuǎn)缺氧引起的細胞活力增加和凋亡減少。免疫共沉淀實驗提示KLF5和HIF-1α存在直接關(guān)聯(lián)，且缺氧環(huán)境中沉淀的目的蛋白更多。此外，沉默KLF5可以降低HIF-1α的水平，而KLF5表達不受HIF-1α的影響，確定了KLF5是HIF-1α的上游調(diào)控因子。
　　結(jié)論：本研究證實缺氧是一個促癌因素，在肺癌