Siah及OS-9調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶在缺氧性肺動(dòng)脈高壓形成中的作用.pdf

1、背景：缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是調(diào)節(jié)機(jī)體組織細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄活性和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與人類多種疾病有關(guān)，在缺氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）中與缺氧性肺血管重塑（HPVR）密切相關(guān)，是缺氧性肺血管重塑形成中調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的“分子開(kāi)關(guān)”。脯氨酰羥化酶（PHDs）催化缺氧誘導(dǎo)因子氧依賴性降解區(qū)域兩個(gè)脯氨酸殘基的羥基化是缺氧誘導(dǎo)因子氧依賴性降解的前提條件。多種小分子生物活性物質(zhì)可通過(guò)不同途徑影響PHDs 的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性，體外培養(yǎng)細(xì)胞中

2、OS-9可與HIF-1α、PHD2結(jié)合，增強(qiáng)PHD2的催化活性， Siah2(seven in absentia 2)可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)PHD1與PHD3的降解，并進(jìn)而調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子及下游靶基因的表達(dá)。 目的：研究大鼠HPH模型和COPD患者肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中Siah、OS-9表達(dá)變化的規(guī)律及與PHDs和HIFs-α的相關(guān)關(guān)系，闡明Siah、OS-9調(diào)控PHDs蛋白表達(dá)與酶活性在HPH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。探討H

3、IF-1α的DNA結(jié)合活性與蛋白表達(dá)在HPH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律，為HIF-1α在HPH形成中的作用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)共分兩部分。第一部分實(shí)驗(yàn)復(fù)制HPH大鼠模型（10％ O2，每天間斷缺氧8小時(shí)，共21天），在缺氧0天（對(duì)照組）、3天、7天、14天和21天不同時(shí)間點(diǎn)，用右心導(dǎo)管法測(cè)定大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mPAP），稱量法計(jì)算右心室肥大指數(shù)（RVHI），HE染色進(jìn)行肺小動(dòng)脈重塑（HPVR）指標(biāo)觀察。原位雜交、R

4、T-PCR檢測(cè)肺內(nèi)Siah1、Siah2、OS-9、PHDs及HIFs-α的mRNA表達(dá)水平及部位，免疫組化、western blot檢測(cè)Siah1、Siah2、OS-9、PHDs及HIFs-α的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及部位，EMSA法檢測(cè)肺組織HIF-1αDNA結(jié)合活性的表達(dá)變化。第二部分通過(guò)HE染色檢測(cè)COPD患者和對(duì)照組患者肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)用原位雜交檢測(cè)肺小動(dòng)脈壁內(nèi)Siah1、Siah2、OS-9、PHDs及HIFs-α mRNA的

5、表達(dá)水平，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肺小動(dòng)脈壁內(nèi)Siah1、Siah2、OS-9、PHDs及HIFs-α蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 結(jié)果： （1）從缺氧7d 起mPAP 較Control組明顯增高( P < 0.05 ) , 14d 達(dá)高水平，并維持于此水平；RVHI 則從缺氧14d 起較Control組升高( P < 0.05)；缺氧7d WA ％、LA ％較對(duì)照明顯改變( P < 0.05)，出現(xiàn)肺血管重塑。HIF-1αmRNA在Con

6、trol組肺小動(dòng)脈血管壁有一定表達(dá)，缺氧3d HIF-1αmRNA 相對(duì)量無(wú)明顯變化，缺氧14d后表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，HIF-1α蛋白在對(duì)照組有一定的表達(dá)，缺氧3d組蛋白質(zhì)明顯升高(P＜0.05，與對(duì)照組比)，缺氧7d達(dá)高峰，此后表達(dá)稍下降。HIF-2α mRNA在對(duì)照組肺動(dòng)脈血管壁表達(dá)陽(yáng)性，缺氧3天后表達(dá)略增高(P＜0.05)，此后基本維持在此水平。HIF-2α蛋白質(zhì)缺氧14d表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，缺氧21天達(dá)到高峰

7、。HIF-3α蛋白質(zhì)及HIF-3α mRNA缺氧14天達(dá)高峰，缺氧21天保持高水平。 （2）Control組大鼠肺小血管PHD1mRNA呈陽(yáng)性表達(dá)，缺氧后其相對(duì)量無(wú)明顯變化，各缺氧組與Control組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05），Control組PHD1蛋白質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá)，缺氧3d、7d后無(wú)明顯變化，缺氧14d顯著下降，缺氧21d維持較低水平。Control組大鼠肺小血管PHD2mRNA呈弱陽(yáng)性表達(dá)，缺氧3d增高，缺氧14d達(dá)

8、高峰，缺氧21d保持高水平，Control組PHD2蛋白質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá)，缺氧3d表達(dá)增高，缺氧14d達(dá)高峰，缺氧21d保持較高水平。Control組肺小血管PHD3mRNA呈弱陽(yáng)性表達(dá)，缺氧3d后迅速增高，缺氧14d達(dá)高峰，缺氧21d保持高水平，Control組PHD3蛋白質(zhì)呈弱陽(yáng)性表達(dá)，缺氧3d明顯增高，缺氧7d保持高水平，缺氧14d和21d下降但仍高于對(duì)照組。 （3）Control組大鼠肺小血管Siah1mRNA呈弱陽(yáng)性表達(dá)，

9、缺氧7d后顯著增高，缺氧14d達(dá)高峰，缺氧21d下降但仍高于Control組，Control組Siah1蛋白質(zhì)呈弱陽(yáng)性表達(dá)，缺氧7d后顯著增高，缺氧14d達(dá)高峰，缺氧21d下降但仍高于Control組。Siah2mRNA和蛋白質(zhì)在各組表達(dá)的變化趨勢(shì)與Siah1相一致。Control組大鼠肺小血管OS-9mRNA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，缺氧3d后迅速降低，缺氧14d達(dá)到最低水平，缺氧21d保持在低水平，Control組OS-9蛋白質(zhì)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，缺

10、氧3d開(kāi)始下降，缺氧14d達(dá)最低水平，缺氧21d稍微增高，但與14d比較差異無(wú)顯著性。直線相關(guān)分析表明，在缺氧組大鼠中Siah蛋白質(zhì)與HIF-2α、HIF-3α蛋白質(zhì)及mPAP、RVHI、WA ％呈正相關(guān)，與PHD1、PHD3蛋白質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。OS-9蛋白質(zhì)與HIF-2α、HIF-3α蛋白質(zhì)及mPAP、RVHI、WA ％、LA ％呈負(fù)相關(guān)。 （4）COPD患者肺小血管HIFs-α mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均增高，蛋白質(zhì)增高更明顯，CO

11、PD患者PHD1 mRNA與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性意義，PHD2、PHD3 mRNA表達(dá)明顯增高，PHD1蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，PHD2蛋白質(zhì)水平升高，PHD3較對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性。COPD患者OS-9蛋白質(zhì)與mRNA表達(dá)均降低，與對(duì)照組比較差異有顯著性，COPD組Siah1和Siah2蛋白質(zhì)與mRNA的表達(dá)均有升高，與對(duì)照組比較差異有顯著性。直線相關(guān)分析表明，Siah1、Siah2蛋白質(zhì)與HIFs-α蛋白質(zhì)正相關(guān)，與PHD1蛋白質(zhì)負(fù)

12、相關(guān)。OS-9蛋白質(zhì)與HIFs-α蛋白負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： （1）大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中HIF-1α DNA結(jié)合活性的表達(dá)差異可能是缺氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。 （2）在缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型及COPD患者中Siah1與Siah2可能通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)PHDs的蛋白穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)節(jié)，間接對(duì)HIFs起正調(diào)控作用。 （3）在缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型及COPD患者中，OS-9可能通