攜改良型HBVpre-SI基因表達(dá)載體的構(gòu)建及相關(guān)研究.pdf

1、目的:肝臟疾病是世界性的常見(jiàn)疾病,現(xiàn)有的治療方法卻不理想,基因治療將可能是治療最為有效方法。然而,目前肝病的基因治療進(jìn)展緩慢,其中最主要的因?yàn)槭侨狈Ω咝У?、肝?xì)胞特異性的載體。因此,研制出高效的嗜肝性基因治療載體,是肝病基因治療取得實(shí)質(zhì)進(jìn)展的關(guān)鍵。pre-S1蛋白含有HBV和肝細(xì)胞膜結(jié)合的位點(diǎn),該位點(diǎn)位于第21～47位氨基酸,是重要的免疫介導(dǎo)部位,肝細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞均可表達(dá)針對(duì)這一肽段的受體,變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。本

2、研究采用基因重組技術(shù),將HBV表面蛋白中嗜肝性成分的基因編碼作無(wú)免疫原性修改后,構(gòu)建出攜改良型HBVpre-S1基因表達(dá)載體,為下一步嗜肝性重組腺相關(guān)病毒微球的制備提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
　　 方法:以我國(guó)HBV流行株adr的DNA為模板,PCR法提取并擴(kuò)增pre-S1的編碼基因HBVpre-S1,然后將提取的HBVpre-S1基因用定點(diǎn)突變延伸的方法,通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的PCR擴(kuò)增反應(yīng),將預(yù)設(shè)的突變構(gòu)建在重疊區(qū)域,同時(shí)存在于兩個(gè)擴(kuò)增片段

3、中,混合得到的兩個(gè)重疊DNA片段,用兩條分別與兩個(gè)原始片段末端結(jié)合的引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,將硬性較強(qiáng)的脯氨酸用柔性較大的丙氨酸替換,完成HBVpre-S1基因的突變。將突變后的HBVpre-S1基因片段通過(guò)雙酶切,轉(zhuǎn)化到制備好的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中,在酚／氯仿抽提純化,將重組質(zhì)粒測(cè)序后,用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109后鋪板于SD／Trp進(jìn)行篩選。挑取(2～3)mm大小的菌落過(guò)夜培養(yǎng)后,提取酵母蛋白質(zhì),按常規(guī)方法分析表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行十

4、二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western免疫印跡分析。
　　 結(jié)果:成功擴(kuò)增出HBV流行株adr的HBVpre-S1基因片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析顯示擴(kuò)增片段約357bp,基因測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確,與預(yù)期片段符合,且無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。通過(guò)片段重疊延伸法,成功將硬性較強(qiáng)的脯氨酸替換成柔性較大的丙氨酸,完成HBVpre-S1基因的突變。分別用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及PstI進(jìn)行雙

5、酶切,連接到用相同酶切的pGBKT7質(zhì)粒載體上,經(jīng)酶切鑒定結(jié)果正確,重組質(zhì)粒pGBKT7-HBVpre-S1構(gòu)建成功。用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母后在SD／Trp培養(yǎng)基上篩選生長(zhǎng)。培養(yǎng)數(shù)天后,挑取一菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增HBVpre-S1蛋白基因,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化成功。提取未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒的酵母蛋白質(zhì),進(jìn)行SDS-PAGE和Western免疫印跡分析,結(jié)果顯示對(duì)照無(wú)表達(dá)而轉(zhuǎn)化了pGBKT7-HBVpre-S1的印跡分析可見(jiàn)明顯目的條帶且無(wú)雜帶。