跨膜型腫瘤壞死因子alpha反向信號在乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥中的作用.pdf

1、第一部分：tmTNF-α反向信號在乳腺癌內(nèi)分泌耐藥中的作用
　　跨膜型腫瘤壞死因子alpha(transmembrane tumor necrosis factor alpha, tmTNF-α)既可作為配體,與靶細胞TNFR結(jié)合,向靶細胞傳遞正向信號,對靶細胞發(fā)揮效應(yīng);又可作為受體,與可溶性或膜TNFR結(jié)合,向效應(yīng)細胞自身傳遞反向信號,介導(dǎo)效應(yīng)細胞的生物學(xué)效應(yīng)。本室前期工作證實腫瘤細胞高表達tmTNF-α,可通過其反向信號保護腫

2、瘤細胞抵抗分泌型TNF-α(secretory tumor necrosis factor alpha,sTNF-α)誘導(dǎo)的凋亡;同時證明高表達TNF-LS誘導(dǎo)MCF-7細胞抵抗sTNF-α的胞毒作用,也誘導(dǎo)其抵抗化療。那么,tmTNF-α是否也能通過其反向信號誘導(dǎo)乳腺癌細胞抵抗內(nèi)分泌治療呢?如是,其機制如何?這些問題迄今未見到相關(guān)報道。
　　本研究通過將tmTNF-α及其反向信號相關(guān)突變體轉(zhuǎn)染至MCF-7乳腺癌細胞,證實tmTN

3、F-α反向信號與內(nèi)分泌治療耐藥之間的關(guān)系,并闡明其分子機制。為提高乳腺癌對內(nèi)分泌治療的敏感性提供實驗依據(jù),為乳腺癌和其它腫瘤的治療提供新的思路和靶點。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.tmTNF-α反向信號導(dǎo)致MCF-7細胞內(nèi)分泌治療耐藥:MCF-7細胞幾乎不表達TNF-α,將wtTNF-α及其突變體轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞,用tamoxifen作用48 h,結(jié)果證實轉(zhuǎn)染tmTNF-α或TNF-LS使tamoxifen對MCF-7細

4、胞生長抑制明顯低于轉(zhuǎn)染wtTNF-α及對照細胞。提示tmTNF-α反向信號導(dǎo)致MCF-7細胞對內(nèi)分泌治療耐藥。
　　2.tmTNF-α反向信號導(dǎo)致MCF-7細胞NF-κB組成性活化:穩(wěn)轉(zhuǎn)TNF-LS可導(dǎo)致MCF-7細胞的IκB明顯降解,tamoxifen并不能明顯影響TNF-LS的作用。提示tmTNF-α反向信號導(dǎo)致MCF-7細胞NF-κB組成性活化。
　　3.NF-κB抑制劑可逆轉(zhuǎn)tmTNF-α反向信號介導(dǎo)的內(nèi)分泌治療耐藥

5、性:用tamoxifen作用于MCF-7細胞和MCF-7/TNF-LS穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞后,MCF-7/TNF-LS穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的生長抑制率明顯低于對照組;NF-κB抑制劑可完全阻斷tmTNF-a反向信號介導(dǎo)的MCF-7細胞對內(nèi)分泌治療的耐藥性,使之對Tamoxifen的敏感性明顯增加。提示tmTNF-α反向信號可能通過活化NF-κB導(dǎo)致MCF-7細胞對內(nèi)分泌治療發(fā)生耐藥。
　　4.tmTNF-α磷酸化位點突變體構(gòu)建:為進一步研究tmTNF-a

6、反向信號介導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生內(nèi)分泌治療耐藥,我們構(gòu)建了三種突變體:(1)構(gòu)建-75位絲氨酸點突變重組體pIRES2-EGFP-S-75R tmTNF-a;(2)構(gòu)建-72位絲氨酸點突變重組體pIRES2-EGFP-S-72R tmTNF-a;(3)構(gòu)建-75與-72位絲氨酸同時點突變重組體pIRES2-EGFP-S-75R/S-72R tmTNF-a。
　　5.tmTNF-α-72位磷酸化位點突變逆轉(zhuǎn)MCF-7細胞對內(nèi)分泌治療耐藥:

7、(1)將上述不同突變體轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞,-72位點突變或兩個絲氨酸同時突變明顯抑制tmTNF-α誘導(dǎo)的IκB降解,而-75位點突變則無效應(yīng)。提示-72位絲氨酸在tmTNF-α反向信號介導(dǎo)的內(nèi)分泌治療耐藥中發(fā)揮重要作用;(2)轉(zhuǎn)染tmTNF-α使MCF-7細胞對tamoxifen明顯耐藥,而轉(zhuǎn)染S-72R tmTNF-α則可提高MCF-7細胞對之的敏感性;(3)轉(zhuǎn)染S-72R tmTNF-α可阻斷tmTNF-α導(dǎo)致的IκB降解, ta

8、moxifen對之無明顯影響;(4)應(yīng)用NF-κB抑制劑可恢復(fù)轉(zhuǎn)染tmTNF-α的MCF-7細胞對內(nèi)分泌治療的敏感性。
　　第二部分：pEGFP-N1-His-TNF-LS構(gòu)建
　　TNF-α是具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子,具有兩種活性形式:跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α。tmTNF-α是sTNF-α的前體,在N端比sTNF-α多了76個氨基酸的信號肽(leader sequence, LS)。研究表明

9、,TNF-LS不但介導(dǎo)tmTNF-α反向信號,而且其胞內(nèi)段可被SPPL2a/2b水解,入核,誘導(dǎo)某些基因表達。而我們前期結(jié)果表明,用針對TNF-LS胞外段的抗體檢測腫瘤組織對tmTNF-α的表達,發(fā)現(xiàn)胞核可著色,提示TNF-LS可能內(nèi)化入核。
　　為證實上述設(shè)想,本研究構(gòu)建pEGFP-N1-His-TNF-LS融合表達載體,使TNF-LS的胞內(nèi)段端帶有His標(biāo)簽,胞外段與EGFP融合表達,為后續(xù)利用免疫熒光在胞內(nèi)追蹤和定位奠定基礎(chǔ)

10、。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.重組體的構(gòu)建和克隆:以pIRES2-EGFP-TNF-LS質(zhì)粒為模板,用加入His標(biāo)簽的引物以PCR的方法擴增出目的片段His-TNF-LS,用BamH I和EcoRI對目的基因和pEGFP空載體雙酶切,再用T4 DNA連接酶連接,獲得pEGFP-N1-His-TNF-LS重組質(zhì)粒,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,挑取陽性克隆鑒定。
　　2.陽性克隆的鑒定:用菌落PCR篩選陽性克隆,然后用上述限