偽狂犬病毒EP0基因特異性siRNA分子的合成與篩選及對病毒復(fù)制的影響.pdf

1、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種嗜神經(jīng)的α皰疹病毒，引起豬的繁殖障礙和多種家畜與野生動(dòng)物的致死性感染，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。一旦感染豬群即可在神經(jīng)組織中建立潛伏感染。在潛伏感染期，在體內(nèi)檢測不到病毒粒子，也不向外排毒，而在應(yīng)激因素的刺激下，潛伏感染被激活，重新產(chǎn)生感染性病毒粒子，導(dǎo)致動(dòng)物再次發(fā)病，并傳播給其它動(dòng)物。疫苗免疫只能預(yù)防動(dòng)物不發(fā)病，但不能阻止PRV潛伏感染的建立與重新激活，因此潛伏感染是

2、偽狂犬病根除計(jì)劃的重要障礙。 皰疹病毒潛伏感染的發(fā)生、維持與激活的機(jī)理尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒在潛伏感染期產(chǎn)生一種“潛伏感染相關(guān)轉(zhuǎn)錄物（latency-associated transcript, LAT），其與潛伏感染之間的關(guān)系還不清楚。在PRV基因組中，LAT與病毒復(fù)制必需的早期基因IE180及EPO反向重復(fù)，因此，采取傳統(tǒng)基因突變技術(shù)不能分別研究這些基因的功能及其與潛伏感染的關(guān)系。RNA干擾（RNA interfere

3、nce，RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)為皰疹病毒潛伏感染的研究提供了有力的手段，該技術(shù)可在不影響基因組結(jié)構(gòu)的情況下在RNA水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而成為研究基因功能的用力工具。EPO基因是PRV的早期基因，它與PRV的立即早期基因IEl80一起調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制。因此，研究EPO基因的時(shí)空表達(dá)對解析PRV復(fù)制與潛伏感染的機(jī)理具有重要的參考意義。 本研究首先在大腸桿菌中高效表達(dá)了EPO基因，并用純化的表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔，制備了多克隆抗體，建立了We

4、stern-blot方法，為PRV復(fù)制和潛伏感染過程中EPO基因表達(dá)的研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究按照美國Ambion公司建議的siRNA分子設(shè)計(jì)原則（www.ambion.com），設(shè)計(jì)并合成了3個(gè)針對PRV Ea株EPO基因的siRNA模板EPO4、EPO8和EP12，分別克隆到siRNA表達(dá)載體pSilencer 4.1-CMV neo的CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建相應(yīng)的重組表達(dá)質(zhì)粒p4.1-EPO4、p4.1-EPO8和p4.1-

5、EP12。同時(shí)，將EPO基因的編碼區(qū)克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N3中，按照讀碼框架與EGFP基因的5’端融合，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pEPO-EGFP。將p4.1-EPO4、p4.1-EPO8、p4.1-EP12和陰性對照質(zhì)粒p4.1-NK分別與pEPO-EGFP共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀和半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，三個(gè)siRNA分子均能不同程度地特異性抑制EPO基因的表達(dá)，抑制效率從高到低依次為EPO8、E

6、P12和EPO4。 最后，研究了上述3個(gè)siRNA分子對PRV復(fù)制和EPO基因表達(dá)的影響。將siRNA表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后22h接種PRV Ea株。細(xì)胞病變觀察、FCID<,50>測定、半定量RT-PCR檢測和Western-blot分析結(jié)果表明，三種siRNA分子均能抑制PRV的復(fù)制和EPO基因的表達(dá)，mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的分析結(jié)果一致，抑制效率與共轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選模型一致。 抗EPO蛋白多克隆抗體