拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞的力學生物學影響及作用機制研究.pdf

1、目的：成骨細胞被認為是力學信號轉導過程中對應力應變信號進行感知的主要力學敏感性細胞，但體外培養(yǎng)時，應力（應變）水平和細胞反應程度間的關系及細胞間信號轉導的機制還不是十分清楚。本文以生物力學為基礎，采用四點彎曲拉伸裝置，研究不同時間和周期的拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞的影響及其作用機制。
　　 方法：
　　 1.研究運用四點彎曲拉伸裝置對小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞分別施加頻率為0.5Hz，不同強度(2500μ

2、ε、5000με)，不同時間(1min、3min、5min、10min)的拉伸應變，另設0με(control group)做為對照組，采用熒光分光光度法檢測各組細胞的熒光強度值，探討拉伸應變對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響。
　　 2.分別給MC3T3-E1細胞施加2500με、5000με，頻率為0.5Hz，1次/d、1h/次，連續(xù)拉伸3d，同時設有加入鈣離子抑制劑維拉帕米組(Verapamil)及U73122

3、組，另設0με做為對照組，采用熒光分光光度法檢測各組細胞的熒光強度值，分析不同應力下[Ca2+]i、CaM的變化；采用Western-blot技術檢測CaMKⅡβ、CREB、p-CREB的蛋白表達，探討力學載荷對Ca2+-CaM-CaMKⅡβ-CREB信號通路的影響。
　　 結果：
　　 1.拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞[Ca2+]i的影響。熒光分光光度法結果顯示：給MC3T3-E1細胞施加2500με，頻率為0.

4、5Hz，拉伸1min、3min、5min，其[Ca2+]i與對照組(161.00±13.23)相比顯著升高(p＜0.01)，其中3min組拉伸(306.00±5.57)達最高值；當MC3T3-E1細胞施加5000με，頻率為0.5Hz，拉伸1min(290.67±18.34)其[Ca2+]i即達到峰值(p＜0.01)，與對照組相比1min、3min、5min、10min拉伸[Ca2+]i均顯著升高（p＜0.05）。
　　 2.拉

5、伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞CaM活性的影響。結果顯示：MC3T3-E1細胞分別施加2500με、5000με，頻率為0.5Hz，拉伸時間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d，2500μe作用下CaM活性(345.67±80.525)較對照組(234.67±54.42)相比顯著升高(p＜0.05），給予鈣通道阻滯劑Verapamil及磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122后，CaM活性與2500με組相比均顯著下調(diào)(p＜0.01);5

6、000με作用下與對照組相比活性升高但沒有顯著性差異（p＞0.05）；給予Verapamil及U73122后，CaM活性與5000με組相比均顯著下調(diào)(p＜0.01)。
　　 3.拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞CaMKⅡβ蛋白表達的影響。Western-blot結果顯示：MC3T3-E1細胞施加2500με，頻率及拉伸周期同前，CaMKⅡβ蛋白表達(1.1120±0.2112)較對照組(0.8552±0.1488)相比顯著升

7、高（p＜0.05），加入Verapamil和U73122，CaMKⅡβ蛋白表達均顯著下調(diào)（p＜0.05)；當細胞施加5000με時，CaMKⅡβ蛋白表達(0.5870±0.1548)與對照組相比顯著降低(p＜0.05），加入Verapamil，U73122，CaMKⅡβ蛋白表達顯著下調(diào)(p＜0.01)。
　　 4.拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞CREB和p-CREB蛋白表達影響結果顯示：細胞施加2500με、5000με時，

8、CREB蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）；加入抑制劑Verapamil和U73122后，2500με、5000με組CREB蛋白表達仍無顯著變化（p＞0.05）。p-CREB蛋白表達在相同拉伸頻率、拉伸時間2500με組(6.6529土1.2615)蛋白表達量最高，與對照組(3.8407±1.5157)比較具有顯著差異(p＜0.01)，與加入抑制劑Verapamil(p＜0.01)和U73122(p＜0.05)組比較

9、抑制劑組蛋白表達均顯著下調(diào)；相同條件拉伸5000με與加入抑制劑組比較，抑制劑組蛋白表達也顯著下調(diào)（p＜0.05）。
　　 結論：
　　 1.拉伸應變可以引起成骨細胞[Ca2+]i改變，不同時間的拉伸應力(1min、3min、5min)均可以顯著升高[Ca2+]i，2500με組3min出現(xiàn)峰值，而5000με組1min出現(xiàn)峰值，5000με組[Ca2+]i達到峰值的時間早于2500με組。分析認為在細胞受到超生理范圍拉

10、伸應力時，細胞表現(xiàn)出一種應激狀態(tài)，在這種狀態(tài)下細胞內(nèi)鈣庫和控制鈣離子內(nèi)流的膜控通道共同作用提升[Ca2+]i以此來應對突然改變的外環(huán)境，而生理范圍拉伸只需細胞作出正常的應答即可。
　　 改變拉伸頻率和周期后，生理性拉伸刺激可以增強CaM活性，超生理范圍拉伸可以減弱CaM的活性，加入鈣離子阻滯劑后CaM活性與未加入阻滯劑組相比，CaM活性下調(diào)。CaM是細胞內(nèi)主要的鈣結合蛋白，本研究結果說明：力學信號在成骨細胞MC3T3-E1細胞內(nèi)

11、的轉導與細胞內(nèi)[Ca2+]j和CaM活性具相關性。
　　 2.MC3T3-E1細胞施加2500με，頻率為0.5Hz，拉伸時間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d時，CaMKⅡβ蛋白表達顯著上調(diào)，分別加入Verapamil、U73122拉伸2500με、5000με組，蛋白表達均顯著性下降。說明：CaMKⅡβ參與了力學信號在成骨細胞內(nèi)的轉導。
　　 3.CREB是細胞的核轉錄因子，只有被磷酸化后才能進行下一級的信號轉導。

12、實施拉伸應變后細胞內(nèi)p-CREB變化有顯著性差異，2500με組蛋白表達顯著升高，其結果與CaM和CaMKⅡβ的結果完全相同。實驗結果分析認為在拉伸應變作用于成骨細胞引起細胞內(nèi)Ca2+/CaM/CaMKⅡβ/p-CREB一系列連鎖的反應，通過這一過程力學信號轉化為生物學信號傳達到細胞內(nèi)。
　　 4.本研究證實成骨細胞MC3T3-E1細胞受到拉伸刺激，其力學信號是通過Ca2+-CaM-CaMK-CREB信號途徑轉化為生物學效應的。