HT-毒素特異性組分的分離及其在Ht1基因玉米質膜存在結合蛋白的證據(jù).pdf

1、本研究對玉米大斑病菌1號小種毒素的特異性組分進行分離，建立了高效的特異性毒素分離純化方法，并對其進行了紫外波譜分析；用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法，測定了毒素特異性組分對原生質體死亡率的影響；進而用1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)熒光探針標記法和SDS-PAGE電泳法對特異性毒素組分與Htl基因玉米細胞互作過程中的質膜蛋白進行了研究，旨在證明Htl基因玉米細胞質膜上存在特異性毒素組分結合蛋白(TBP)，為從細胞和分子生物學角度闡明毒素

2、的致病機理提供證據(jù)。主要結果如下： 1.對玉米大斑病菌的1號小種菌株(99-2)的粗毒素進行硅膠薄層層析(TLC)，分離到Ⅰ(Rf0.06)、Ⅱ(Rf0.21)、Ⅲ(Rf0.45)、Ⅳ(Rf0.60)、V(Rf0.75)5個條帶，分別對此5個條帶進行生物測定，發(fā)現(xiàn)條帶Ⅱ對帶Htl基因的玉米具有較強的特異性。 2.在檢測波長220nm、流速1.0mL/min的HPLC分析條件下，對條帶Ⅱ的洗脫劑中甲醇與水的比例進行摸索，最

3、后確定60﹪甲醇為最佳洗脫條件。經對條帶Ⅱ進行高效液相色譜(HPLC)的進一步純化，得到3種組分Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3，其中只有Ⅱ-3具有特異致病活性。對Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3進行紫外-可見光譜掃描，發(fā)現(xiàn)只有Ⅱ-3在300nm處有吸收峰，Ⅱ-1和Ⅱ-2的峰形相似，可能為類似物。 3.從HT-毒素Ⅱ-3組分處理玉米幼苗的葉片中提取原生質體，在0-1.5h內其死亡率與對照(蒸餾水處理幼苗)無明顯差別，但1.5h后Ⅱ-3處理一直明顯高

4、于對照，說明Ⅱ-3加速了葉片細胞的死亡；在6h左右處理有顯著上升，而對照變化不大。說明Ⅱ-3與葉片細胞作用后并不直接傷害細胞，而需經過一定時間，這一過程很可能是Ⅱ-3與受體結合后信號不斷放大，最終使原生質體失去活力的過程。 4.以玉米葉片原生質體為研究對象，以ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)作熒光探針，用熒光法研究了Ⅱ-3與質膜蛋白的互作。在被ANS標記后的原生質體懸浮液中加入不同濃度HT-毒素Ⅱ-3組分后，ANS熒光強度明顯增

5、加，呈現(xiàn)出了劑量一效應關系，表明Ⅱ-3與質膜上ANS某些受體發(fā)生了互作。本試驗采用兩種試劑，從兩個角度表明了ANS受體和質膜上存在的Ⅱ-3受體具有蛋白特性。推測HT-毒素特異性組分的原始作用位點在質膜外側，且特異性毒素組分與其受體互作具明顯的飽和性。 5.利用SDS-PAGE電泳技術分析了HT-毒素Ⅱ-3組分對玉米葉片中可溶性蛋白和質膜蛋白的影響。結果表明，Ⅱ-3對葉片中可溶性蛋白沒有影響，但在葉片質膜蛋白中找到了3個與Ⅱ-3致