HT-毒素特異性組分的分離及其在Ht1基因玉米質(zhì)膜存在結(jié)合蛋白的證據(jù).pdf

1、本研究對(duì)玉米大斑病菌1號(hào)小種毒素的特異性組分進(jìn)行分離，建立了高效的特異性毒素分離純化方法，并對(duì)其進(jìn)行了紫外波譜分析；用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法，測(cè)定了毒素特異性組分對(duì)原生質(zhì)體死亡率的影響；進(jìn)而用1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)熒光探針標(biāo)記法和SDS-PAGE電泳法對(duì)特異性毒素組分與Htl基因玉米細(xì)胞互作過(guò)程中的質(zhì)膜蛋白進(jìn)行了研究，旨在證明Htl基因玉米細(xì)胞質(zhì)膜上存在特異性毒素組分結(jié)合蛋白(TBP)，為從細(xì)胞和分子生物學(xué)角度闡明毒素

2、的致病機(jī)理提供證據(jù)。主要結(jié)果如下： 1.對(duì)玉米大斑病菌的1號(hào)小種菌株(99-2)的粗毒素進(jìn)行硅膠薄層層析(TLC)，分離到Ⅰ(Rf0.06)、Ⅱ(Rf0.21)、Ⅲ(Rf0.45)、Ⅳ(Rf0.60)、V(Rf0.75)5個(gè)條帶，分別對(duì)此5個(gè)條帶進(jìn)行生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)條帶Ⅱ?qū)tl基因的玉米具有較強(qiáng)的特異性。 2.在檢測(cè)波長(zhǎng)220nm、流速1.0mL/min的HPLC分析條件下，對(duì)條帶Ⅱ的洗脫劑中甲醇與水的比例進(jìn)行摸索，最

3、后確定60﹪甲醇為最佳洗脫條件。經(jīng)對(duì)條帶Ⅱ進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)的進(jìn)一步純化，得到3種組分Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3，其中只有Ⅱ-3具有特異致病活性。對(duì)Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，發(fā)現(xiàn)只有Ⅱ-3在300nm處有吸收峰，Ⅱ-1和Ⅱ-2的峰形相似，可能為類似物。 3.從HT-毒素Ⅱ-3組分處理玉米幼苗的葉片中提取原生質(zhì)體，在0-1.5h內(nèi)其死亡率與對(duì)照(蒸餾水處理幼苗)無(wú)明顯差別，但1.5h后Ⅱ-3處理一直明顯高

4、于對(duì)照，說(shuō)明Ⅱ-3加速了葉片細(xì)胞的死亡；在6h左右處理有顯著上升，而對(duì)照變化不大。說(shuō)明Ⅱ-3與葉片細(xì)胞作用后并不直接傷害細(xì)胞，而需經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，這一過(guò)程很可能是Ⅱ-3與受體結(jié)合后信號(hào)不斷放大，最終使原生質(zhì)體失去活力的過(guò)程。 4.以玉米葉片原生質(zhì)體為研究對(duì)象，以ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)作熒光探針，用熒光法研究了Ⅱ-3與質(zhì)膜蛋白的互作。在被ANS標(biāo)記后的原生質(zhì)體懸浮液中加入不同濃度HT-毒素Ⅱ-3組分后，ANS熒光強(qiáng)度明顯增

5、加，呈現(xiàn)出了劑量一效應(yīng)關(guān)系，表明Ⅱ-3與質(zhì)膜上ANS某些受體發(fā)生了互作。本試驗(yàn)采用兩種試劑，從兩個(gè)角度表明了ANS受體和質(zhì)膜上存在的Ⅱ-3受體具有蛋白特性。推測(cè)HT-毒素特異性組分的原始作用位點(diǎn)在質(zhì)膜外側(cè)，且特異性毒素組分與其受體互作具明顯的飽和性。 5.利用SDS-PAGE電泳技術(shù)分析了HT-毒素Ⅱ-3組分對(duì)玉米葉片中可溶性蛋白和質(zhì)膜蛋白的影響。結(jié)果表明，Ⅱ-3對(duì)葉片中可溶性蛋白沒有影響，但在葉片質(zhì)膜蛋白中找到了3個(gè)與Ⅱ-3致