維生素D類似物EB1089對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 前列腺癌在美國(guó)是男性最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，腫瘤死亡率位居第二。近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌的檢出率已呈明顯上升趨勢(shì)。目前，晚期雄激素非依賴型前列腺癌(AIPC)的治療仍是一個(gè)難題，尚無(wú)理想的治療方法。因此，研究和探索新的治療策略，具有十分重要的臨床意義。
　　 研究表明，Hedgehog(Hh)信號(hào)通路的激活與前列腺癌密切相關(guān)。人前列腺癌組織表達(dá)Hh配體及其下游靶基因Gli。Hh信號(hào)通路抑制劑cyclopamin

2、e(環(huán)杷明)能抑制前列腺癌腫瘤細(xì)胞增殖、改變其侵襲能力、抑制移植腫瘤的生長(zhǎng)并引起消退。但cyclopamine因含量少，合成困難，副作用大，限制了其臨床應(yīng)用。最近研究發(fā)現(xiàn)維生素D也是一種Hh信號(hào)通路抑制劑，以很高的親和力結(jié)合Smo，抑制Gli活性，且作用強(qiáng)于cyclopamine。
　　 前列腺癌的多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致其化療失敗的主要原因，腫瘤細(xì)胞MDR的發(fā)生與細(xì)胞膜上過(guò)量表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，包括P-型糖蛋白(PGP)

3、、多藥耐藥蛋白(MRP)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等，它們可以將化療藥物泵出細(xì)胞外從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。研究表明，Hh通路抑制劑是一種有效的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，特別是對(duì)PGP、BCRP具有很強(qiáng)的抑制作用。
　　 然而，維生素D可引起高血鈣的副作用影響了其在抗腫瘤領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。EB1089是一種維生素D類似物，具有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的作用，而對(duì)血鈣的影響較小。本研究旨在探討EB1089是否作為一種Hh通路抑制

4、劑，通過(guò)Hh信號(hào)通路途徑抑制雄激素非依賴型前列腺癌DU145細(xì)胞生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)其MDR。
　　 方法與結(jié)果：
　　 首先采用MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)EB1089對(duì)DU145細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響，并與cyclopamine作比較，同時(shí)在光鏡和電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，EB1089可以抑制DU145細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，且抑制作用強(qiáng)于cyclopamine。1、10、

5、50、100nmol/L EB1089作用DU145細(xì)胞48h后，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，而S期細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞凋亡率逐步增高。EB1089作用后，鏡下可見(jiàn)DU145細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮、裂解，核碎片及凋亡小體形成。
　　 其次，分別用1、10、50、100nmol/L濃度的EB1089作用DU145細(xì)胞48h后，采用Real time-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)DU145細(xì)胞

6、Gli1、cyclinD1、BCL-2、Bax mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，EB1089作用48h后，DU145細(xì)胞Gli1、cyclinD1、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均下降，Bax mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，并呈劑量依賴關(guān)系。
　　 最后，MTT法檢測(cè)EB1089和多西紫杉醇二者合用對(duì)DU145細(xì)胞增殖的作用，以及EB1089對(duì)耐多西紫杉醇DU145細(xì)胞(DU145-DR)化學(xué)敏感性的影響；并采用Real tim

7、e-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)EB1089作用后DU145-DR細(xì)胞PGP/MDR1、MRP、BCRP mRNA和蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合對(duì)DU145細(xì)胞增殖的抑制作用顯著高于兩藥單獨(dú)作用；DU145-DR細(xì)胞經(jīng)EB1089作用后對(duì)多西紫杉醇的敏感性增加，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.87，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為70.8％；EB1089作用后，DU145-DR細(xì)胞PGP/MDR1、BCRP的表達(dá)水平顯著下調(diào)。
　　 結(jié)論：<

8、br>　　 EB1089可以抑制DU145細(xì)胞增殖，抑制作用于強(qiáng)于cyclopamine，EB1089可以阻滯DU145細(xì)胞于G1期，誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是作為一種有效的Hh信號(hào)通路抑制劑，通過(guò)抑制Hh信號(hào)通路，下調(diào)Gli1，進(jìn)而調(diào)節(jié)cyclinD1、Bcl-2和Bax的表達(dá)來(lái)完成。EB1089可以提高耐多西紫杉醇DU145細(xì)胞的化學(xué)敏感性，有效逆轉(zhuǎn)其耐藥性，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能主要通過(guò)下調(diào)PGP/MDR1、BCRP的表達(dá)