SORAFENIB對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是西方國(guó)家最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率居西歐國(guó)家男性惡性腫瘤的第二位，死亡率位于男性惡性腫瘤患者的首位。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖然遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，但是近年來(lái)我國(guó)前列腺癌的檢出率和發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)，己位居泌尿系腫瘤的第三位，甚至第二位。并且一半以上前列腺癌患者確診時(shí)已經(jīng)是所謂的局部進(jìn)展性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌，失去根治性手術(shù)治療機(jī)會(huì)，只能采用雄激素阻斷為主的內(nèi)分泌綜合治療，多數(shù)患者會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾?lài)型前列腺癌，而該類(lèi)前列

2、腺癌對(duì)化療的應(yīng)答率低?？偟膩?lái)說(shuō)，目前對(duì)該類(lèi)患者的治療總體療效較差，雄激素依賴(lài)型前列腺癌向雄激素非依賴(lài)型前列腺癌的轉(zhuǎn)變，以及雄激素非依賴(lài)型前列腺癌的治療成為目前研究的焦點(diǎn)。 Sorafenib(Nexavar，Bayer-Onyx BAY 43-9006)是一種小分子雙芳香基碳酰胺，最初被認(rèn)為是一種口服的抑制Raf激酶的小分子激酶抑制劑，隨后的研究表明Sorafenib能抑制VEGFR-2，VEGFR-3，PDGFR-b等多個(gè)生長(zhǎng)

3、因子受體激酶，也能降低RET和BCL-2的表達(dá)，Sorafenib還能夠降低Mcl-1蛋白水平和eIF4E磷酸化水平，是一種多靶點(diǎn)抑制劑。系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明Sorafenib能抑制腎癌、黑色素瘤、肺癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Sorafenib作為一種靶向作用于Raf激酶與血管生成的抑制劑，還被視為無(wú)耐藥性的新型抗癌藥物，并且可以逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)這些腫瘤細(xì)胞P糖蛋白(p-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥(MDR)。目前的研究

4、認(rèn)為前列腺癌雄激素依賴(lài)向雄激素非依賴(lài)的轉(zhuǎn)變及前列腺癌對(duì)化療的低應(yīng)答率均與前列腺癌的MDR現(xiàn)象有重要關(guān)系。 本課題采用光鏡和電鏡，流式細(xì)胞技術(shù)，MTT等技術(shù)從細(xì)胞水平觀察Sorafenib對(duì)體外培養(yǎng)的前列腺癌雄激素非依賴(lài)型細(xì)胞株DU145細(xì)胞增殖和凋亡的影響；用Western-blot法檢測(cè)DU145細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵蛋白表達(dá)變化，初步探討Sorafenib體外抑制DU145細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡的機(jī)制；用MTT技術(shù)觀

5、察DU145/ADM細(xì)胞增殖，以及RT-PCR和Western-blot的方法檢測(cè)MDR-1基因mRNA及其產(chǎn)物p-gp蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)Sorafenib對(duì)DU145/ADM細(xì)胞的MDR的逆轉(zhuǎn)作用。 第一部分 Sorafen-b抑制DU145細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀察Sorafenib對(duì)雄激素非依賴(lài)型前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。 方法:以不同濃度的Sorafen

6、ib作用于體外培養(yǎng)的DU145細(xì)胞不同時(shí)間，用顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化，MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化。 結(jié)果:0.5、1、2、5、10、15、20μmol/L Sorafenib作用DU145細(xì)胞24h、48h、72h后對(duì)DU145細(xì)胞增殖均有抑制作用，除0.5μmol/L組作用24h與對(duì)照組無(wú)顯著差異外，其他各組之間均有顯著差異，抑制呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。Sorafeni

7、b能引起DU145細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮、裂解、核碎片及凋亡小體形成。0、2、5、7、10、15umol/L Sorafenib作用48h后，DU145細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)比例分別為45.4％、51.7％、55.0％、63.7％、67.0％、74.7％，凋亡細(xì)胞率分別為0.28％、7.6％、11％、18.5％、23.2％、28.4％。 結(jié)論:Sorafenib能抑制體外培養(yǎng)的雄激素非依賴(lài)型前列腺癌DU14

8、5細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系；Sorafenib能阻滯DU145細(xì)胞于G1期，誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡，有劑量依賴(lài)關(guān)系。 第二部分Sorafenib抑制DU145細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡的機(jī)制 目的:探討Sorafenib抑制雄激素非依賴(lài)型DU145細(xì)胞株細(xì)胞增殖、阻滯DU145細(xì)胞周期及誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法:分別用5umol/L、10umol/L、15umol/L濃度的Sorafe

9、nib作用DU145細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，用Western-blot方法檢測(cè)DU145細(xì)胞t-ERK、P-ERK、t-AKT、P-AKT、PTEN、BCL-2、cyclinD1蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果:Sorafenib作用2h后，DU145細(xì)胞t-ERK、t-AKT、P-AKT與對(duì)照組比較無(wú)變化，而p-ERK隨著Sorafenib作用劑量增加，磷酸化水平逐漸降低；Sorafenib作用24h后，t-ERK、t-AKT無(wú)變化，而p-ER

10、K、P-AKT隨著Sorafenib作用劑量增加磷酸化水平逐漸降低；Sorafenib作用24h后，隨著Sorafenib作用劑量增加，BCL-2、cyclinD1蛋白的表達(dá)逐漸減少，而PTEN蛋白表達(dá)逐漸增加。 結(jié)論:Sorafenib所致的p-ERK、p-AKT、BCL-2、cyclinD1表達(dá)下調(diào)，誘導(dǎo)PTEN表達(dá)上調(diào)可能是Sorafenib抑制雄激素非依賴(lài)型DU145細(xì)胞株細(xì)胞增殖、阻滯DU145細(xì)胞周期及誘導(dǎo)DU145

11、細(xì)胞凋亡的主要作用機(jī)制。 第三部分 Sorafenib對(duì)DU145/ADM細(xì)胞阿霉素化療敏感性影響的研究 目的:觀察Sorafenib對(duì)DU145/ADM(耐AMD的DU145細(xì)胞)細(xì)胞阿霉素化療敏感性的影響。 方法:用MTT法觀察Sorafenib和阿霉素合用對(duì)DU145細(xì)胞增殖的抑制作用；分別用MTT法檢測(cè)Sorafenib作用前后阿霉素對(duì)DU145/ADM增殖的抑制、RT-PCR法檢測(cè)Sorafenib作用

12、前后DU145/ADM細(xì)胞MDR-1基因mRNA的表達(dá)水平、Westem-blot法檢測(cè)Sorafenib作用前后DU145/ADM細(xì)胞p-gp的表達(dá)水平來(lái)觀察Sorafenib對(duì)DU145/ADM的MDR的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)果:Sorafenib和阿霉素聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞增殖的抑制率高于Sorafenib和阿霉素分別單獨(dú)作用DU145細(xì)胞的抑制率；阿霉素對(duì)經(jīng)Sorafenib處理后的DU145/ADM的抑制率顯著高于Sora

13、fenib處理前的抑制率；經(jīng)Sorafenib處理后，DU145/ADM對(duì)阿霉素的敏感性是處理前的2.16倍；經(jīng)Sorafenib處理后，DU145細(xì)胞MDR-1基因mRNA及其產(chǎn)物p-gp的表達(dá)水平顯著下調(diào)。 結(jié)論:Sorafenib能有效逆轉(zhuǎn)p-gp介導(dǎo)雄激素非依賴(lài)型前列腺癌的MDR，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能主要通過(guò)下調(diào)MDR-1基因mRNA水平和p-gp蛋白的表達(dá)，PTEN、BCL-2、Raf/MER/ERK信號(hào)通路可能參與了逆轉(zhuǎn)過(guò)