人SIRT1基因cDNA內(nèi)皮細(xì)胞特異轉(zhuǎn)基因鼠系的建立及其對動脈粥樣硬化的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，雖然其發(fā)病機(jī)制現(xiàn)在尚未闡明，但是大量研究證明內(nèi)皮細(xì)胞功能失常是其發(fā)生的重要條件，在有明顯的病理變化之前內(nèi)皮細(xì)胞功能失常已經(jīng)存在。內(nèi)皮細(xì)胞功能失常有諸多表現(xiàn)，其中內(nèi)皮細(xì)胞特異的一氧化氮合酶(eNOS)基因表達(dá)下降是其重要標(biāo)志，很多動脈粥樣硬化的危險因素都可以通過降低eNOS基因表達(dá)水平導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(nitricoxide，NO)減少，使血管處于不正常的緊張狀態(tài)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生。許多

2、對心血管疾病有保護(hù)作用的因素和心血管疾病的有效干預(yù)措施也可通過上調(diào)eNOS表達(dá)來糾正內(nèi)皮細(xì)胞功能失常，達(dá)到預(yù)防和治療動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的目的。因此，繼續(xù)尋找能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)水平的基因，并探索其在內(nèi)皮細(xì)胞功能失常和動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用，將有助于進(jìn)一步闡明動脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)理。 SIRT1(Sirtuin1)是人類的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在各種物種之間呈現(xiàn)高度的保守性，甚至在原核生物中也有其同源基因，在人類的七

3、個Ⅲ類去乙?；赋蓡T中與酵母Sir2(silenceinformationregulator2)的同源性最高。近幾年的深入研究表明，人的SIRT1及其小鼠的同源基因Sir2α在胚胎發(fā)育、組織分化、代謝調(diào)節(jié)和抵抗不良環(huán)境因素?fù)p傷方面發(fā)揮重要作用。SIRT1是通過與多種重要的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用實現(xiàn)其功能的，這些轉(zhuǎn)錄因子包括MyoD、p300、PGC-1α、PPARγ、NF-κB、Ku70、p53以及FOXOs等。因為SIRT1在

4、抵抗不良環(huán)境因素的損傷方面發(fā)揮重要作用，而動脈粥樣硬化的發(fā)生過程與遺傳和環(huán)境危險因素對內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷密切相關(guān)，所以我們認(rèn)為：在內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)SIRT1可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生。為了驗證這個假說，我們進(jìn)行了如下的研究。 首先，在研究內(nèi)皮細(xì)胞的模型一人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huamnumbilicalveinendothelialcell.HUVEC)檢測到了SIRT1的表達(dá)；在氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow

5、densitylipoprotein.oxLDL)作用后HUVEC的SIRT1表達(dá)水平上升，提示SIRT1與oxLDL損傷HUVEC的過程有關(guān)。為了研究SIRT1在體內(nèi)的功能，將SIRT1cDNA與VE-Cadherin啟動子連接，通過顯微注射受精卵的方法制備了內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)SIRT1的轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)過RT-PCR、Westernblot和免疫熒光三種方法證明SIRT1在小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)。為了檢測轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生動脈粥樣硬

6、化程度的變化，將轉(zhuǎn)基因小鼠與動脈粥樣硬化的模型-apoE4-/-小鼠雜交，得到基因型為SIRT1+/apoE-/-的小鼠，以基因型為SIRT1-/apoE-/-的同窩同性別鼠作為對照，隨機(jī)分組喂高脂飲食誘發(fā)動脈粥樣硬化，持續(xù)10周和20周后，檢測主動脈粥樣斑塊的面積變化。結(jié)果顯示，在喂高脂飲食10周的雄性鼠中，陽性鼠動脈粥樣硬化斑塊的面積比對照鼠減少(動脈粥樣斑塊占主動脈總面積的平均值從19.3％減少到13.6％，p＜0.05)。而在喂

7、高脂飲食10周的雌性鼠中，陽性鼠與對照鼠相比動脈粥樣硬化的發(fā)生沒有明顯變化，與在研究其他基因時發(fā)生的情況相似，表明雌性鼠不適宜作為心血管疾病的動物模型，所以在本研究中分析機(jī)制時只針對雄性鼠。在喂20周高脂飲食的鼠中，陽性鼠與對照鼠動脈粥樣硬化的程度也沒有差異，說明SIRT1可能在動脈粥樣硬化發(fā)生的早期有保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用可能不足以對抗不良因素長期作用(如高脂飲食20周)造成的損傷。分析動脈粥樣硬化發(fā)生減少的機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，陽性鼠與對照

8、鼠相比體重、血脂和血糖水平這些系統(tǒng)性因素都沒有變化，因此推測內(nèi)皮細(xì)胞本身的因素變化起到了抑制動脈粥樣硬化發(fā)生的作用，最有可能的是內(nèi)皮細(xì)胞功能失常的改善。因為eNOS表達(dá)水平是內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要指標(biāo)，eNOS水平下降是內(nèi)皮細(xì)胞功能受損的標(biāo)志，而eNOS水平上升是內(nèi)皮細(xì)胞功能改善的指標(biāo)，于是首先檢測eNOS水平的變化，RT-PCR和免疫熒光的結(jié)果都顯示在陽性鼠內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS水平上升。進(jìn)一步用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測SIRT1對eNOS啟