旋毛蟲四種絲氨酸蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)和蟲體定位的研究.pdf

1、旋毛蟲是一種全球范圍分布的危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病。主要發(fā)病原因是因?yàn)樗拗魇秤昧松幕蛭词斓暮懈腥拘园业娜忸愂称范腥?，感染?yán)重時(shí)可致死亡。幾乎所有的哺乳動(dòng)物均可以被感染。近年相繼在幾種寄生蟲分離并鑒定除了絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑具有獨(dú)特的酶抑制活性，能夠保護(hù)寄生蟲抵制宿主消化液的消化，參與寄生蟲在宿主體內(nèi)的移行過程，能夠利于寄生性線蟲的發(fā)育并抵抗宿主的免疫反應(yīng)。
　　根據(jù)NCBI上已發(fā)表的

2、旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑TspAd5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548（其基因序列登錄號(hào)分別為:EU263307、AF231948.1、XM_003379333、XM_003379851）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)分別將克隆的目的片段與pMD-18T克隆載體連接后，各自轉(zhuǎn)化入克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)菌液PCR鑒定和測(cè)序公司測(cè)序后對(duì)克隆到的序列進(jìn)行序列分析正確，隨后制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，并建立相對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光

3、定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　為闡明四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的情況，將收集的不同時(shí)期的旋毛蟲蟲體提取總RNA進(jìn)行RT-PCR，分析不同發(fā)育時(shí)期里旋毛蟲四種Ts-SPI基因在mRNA水平的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示，TspAd5和TS11-1在旋毛蟲感染后3d的成蟲期出現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄高峰，3d時(shí)表達(dá)量明顯高于1d和5d的表達(dá)量(p＜0.01)，5d時(shí)較NBL略低(p＜0.05);成囊前期，表達(dá)量很低，其中18d時(shí)表達(dá)量最

4、低(p＜0.05);另一高峰出現(xiàn)在感染后第38天的肌幼蟲時(shí)期，且差異具有顯著性(p＜0.05)。Tsp03044在成蟲時(shí)期，3d時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量明顯高于其他時(shí)期的表達(dá)量且差異具有極顯著性(p＜0.01);成囊前期中18d時(shí)表達(dá)量最低(p＜0.05)，22d時(shí)轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)高峰(p＜0.01)，差異極顯著。Tsp03548在3d時(shí)轉(zhuǎn)錄略高于1d和5d的表達(dá)量(p＜0.05)，5d時(shí)較NBL略低(p＜0.05)且具有差異顯著性;成囊前期中18d

5、時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄表高峰(p＜0.01);肌幼蟲時(shí)期均有表達(dá)(p＜0.05)且差異顯著。
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光技術(shù)研究四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體內(nèi)分布的情況，并對(duì)四種Ts-SPI與宿主的相互作用進(jìn)行分析。免疫熒光定位結(jié)果顯示，TspAd5和TS11-1在成蟲表皮組織和肌肉蟲的表皮和體內(nèi)均大量表達(dá)，在新生幼蟲和成囊前期幼蟲的蟲體也有表達(dá)。Tsp03044在新生幼蟲的蟲體的體內(nèi)和表皮表達(dá)量略少，在其他時(shí)期的體內(nèi)均明顯可見其紅色

6、熒光效果顯著。Tsp03548明顯可見定位于成囊前期幼蟲的表皮組織和體內(nèi);成蟲的表皮組織和新生幼蟲的蟲體的表皮和體內(nèi)也有表達(dá)，但整體紅色熒光效果很弱;肌幼蟲的體內(nèi)和表皮也均有表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量和蟲體分布的情況進(jìn)行研究，通過應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光定位技術(shù)對(duì)TspAd5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548在不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化和蟲體表達(dá)部位的進(jìn)