NGF介導的Kidins220信號通路在小鼠氣道過敏性免疫反應中的作用.pdf

1、目的：支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的反復發(fā)作的可逆性的氣流受限和氣道高反應性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。我國哮喘發(fā)病率為1％,其中兒童達3％。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)在炎癥反應中起重要作用,是調(diào)控神經(jīng)源性炎癥關(guān)鍵的細胞因子,可通過連接神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)而發(fā)揮放大氣道炎癥的作用。許多研究表明NGF參與哮喘發(fā)病,它通過與其高親和力受體-酪氨酸

2、激酶受體A(tyrosine kinase receptor A,TrkA)及低親和力受體P75結(jié)合在氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑中起重要作用。近年來支氣管哮喘與細胞信號傳導的研究一直受到國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)生不僅僅與免疫炎癥相關(guān),同時神經(jīng)系統(tǒng)也參與了哮喘的發(fā)病。但對于他們之間的相互作用及其機制尚不完全清楚。
　　 Kinase D-interacting substrate of220kDa(KJ

3、dins220),又稱作ankyrin repeat-richmembrane spanning protein(ARMS),是一個跨膜支架蛋白,屬大蛋白,包含大量的蛋白連接區(qū)域,與三種Trk受體和P75受體通過跨膜區(qū)域相互作用。ARMS的作用之一是招募蛋白或受體酶作用底物,ARMS作為蛋白激酶D/Kidins220作用底物,是一種新奇的Trk受體酪氨酸激酶下游蛋白。Kidins220經(jīng)常與Trk和P75共表達形成三元復合物,是唯一的與

4、兩種受體相聯(lián)系的膜蛋白。ARMS在神經(jīng)細胞正常高表達,這提示神經(jīng)功能需要一定的ARMS蛋白調(diào)節(jié)和維持。一系列的銜接蛋白與Trk連接促進細胞內(nèi)多種信號通路,在這些信號通路中,MAPK持續(xù)激活是神經(jīng)營養(yǎng)信號通路獨有的特征。Trk的跨膜區(qū)域和ARMS聯(lián)系。Trk和ARMS的相互作用導致MAP激酶活性增加持續(xù)數(shù)小時,所以說ARMS作為支架蛋白直接參與和調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路。NGF介導的TrkA通路參與哮喘發(fā)病,ARMS參與這條信號通路的調(diào)節(jié)

5、,那么,ARMS有可能也參與哮喘發(fā)病機制,也是哮喘治療的一個靶點。
　　 本研究旨在觀察小鼠氣道過敏性免疫反應過程中NGF介導的Kidins220信號通路是否被激活。研究NGF及TrkA被阻斷后,對Kidins220/ARMS表達的影響;研究Kidins220/ARM被阻斷后,對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應性的作用,及對NF-κB表達的影響。有利于進一步闡明NGF介導的參與哮喘發(fā)病的信號機制,闡明Kidins220/ARMS信號

6、通路是否參與哮喘發(fā)病,為開辟哮喘治療的新途徑提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1、實驗動物的分組清潔級雌性BALB/c小鼠90只,6-8周齡,體重18-20克,購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。按隨機數(shù)字表法分為5組:(1)PBS對照組(n=18);(2)哮喘模型組(n=18);(3)anti-NGF抗體組(n=18);(4)anti-TrkA抗體組(n=18);(5)anti-ARMS抗體組(n=18)。

7、>　　 2、小鼠哮喘模型的制備實驗第1天,哮喘組、anti-NGF抗體組、anti-TrkA抗體組、anti-ARMS抗體組小鼠腹腔注射20pg卵蛋白(ovalbumin,OVA)和2mg氫氧化鋁混合于0.5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中;實驗第8,15,22天,腹腔注射10μgOVA和1mg氫氧化鋁混合于0.5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中;實驗第23天開始,給予4％OVA(PBS配制)霧化吸入,每天一次,每次25-30分鐘至喘息發(fā)作,

8、連續(xù)7天,anti-NGF抗體組,anti-TrkA抗體組及anti-ARMS抗體組在每次霧化吸入OVA前3小時通過鼻腔分別給予anti-NGF抗體,anti-TrkA抗體及anti-ARMS抗體干預。PBS對照組以PBS代替OVA腹腔注射及霧化吸入,其余均與哮喘組相同。
　　 3、氣道反應性測定最后一次吸入OVA24小時后開始檢測氣道反應性。采用梯度濃度的乙酰甲膽堿(methacholine,MCH)激發(fā)氣道高反應,應用Ani

9、Res2005動物肺功能分析系統(tǒng)檢測氣道阻力(吸氣阻力和呼氣阻力)。
　　 4、支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar larvage fluid,BALF)的檢測BALF進行細胞總數(shù)計數(shù)及分類細胞計數(shù),酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELIASA)檢測BALF上清中TNF-α、IL-1β、IL-4的表達水平。BALF細胞涂片應用免疫熒光檢測kidins220及TrkA的表達。
　　 5、蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺

10、組織病理學變化各組小鼠肺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、相同位置切片,HE染色,光鏡下觀察及圖像分析。
　　 6、實時熒光定量RT-PCR定量檢測實時熒光定量RT-PCR定量檢測肺組織中Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4mRNA、FNF-αmRNA含量及統(tǒng)計學處理。
　　 7、免疫印跡(Westem blot)檢測Western blot檢測肺組織kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表達,圖

11、像分析及數(shù)據(jù)處理。
　　 8、凝膠電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)EMSA檢測各組肺組織NFκB結(jié)合活性及統(tǒng)計學處理。
　　 9、統(tǒng)計學處理所有原始數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件分析,所有結(jié)果均以均數(shù)±標準差((-x)+SD)表示,樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法,正態(tài)分布及方差齊時,兩兩比較采用LSD檢驗;非正態(tài)分布采用秩

12、和檢驗;而氣道阻力的比較采用多因素方差分析(two-way ANOVA)。P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、支氣管和肺組織病理學觀察結(jié)果正常對照組小鼠支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)基本正常,支氣管壁無明顯炎性細胞浸潤。哮喘組小鼠支氣管管腔狹窄、管壁增厚,支氣管壁內(nèi)及管周、周圍血管及肺泡內(nèi)可見淋巴細胞及嗜酸粒細胞等炎性細胞浸潤,提示小鼠哮喘模型建模成功。Anti-NGF抗體組、anti-TrkA抗體組、anti-AR

13、MS抗體組小鼠支氣管和肺組織病理改變程度較哮喘組明顯減輕。
　　 2、氣道反應性測定及分析結(jié)果哮喘小鼠對MCH的氣道反應性比正常對照組明顯增強(P＜0.01),表明小鼠哮喘模型建模成功。而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,氣道反應性較哮喘組明顯改善。
　　 3、BALF細胞總數(shù)計數(shù)、分類細胞計數(shù)及分析結(jié)果哮喘組細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞數(shù)明顯高于正常對照組(P

14、＜0.01),而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,炎癥細胞數(shù)較哮喘組明顯減少(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 4、實時熒光定量RT-PCR定量檢測肺組織中Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-α mRNA的表達及分析結(jié)果哮喘組Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-β mRNA表達量明顯高于正常對

15、照組(P＜0.01或P＜0.05),給予anti-ARMS抗體阻斷后,IL-1βmRNA、IL-4 mRNA、TNF-αmRNA表達量較哮喘組明顯減少(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 5、免疫熒光檢測kidins220、TrkA的表達及分析結(jié)果支氣管灌沈液細胞涂片做免疫熒光顯示,kidins220及TrkA共表達于細胞膜和細胞質(zhì),且哮喘組的表達強于正常對照組。
　　 6、ELISA檢測小鼠BALF中TNF-α、IL

16、-1β、IL-4表達及分析結(jié)果哮喘組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-4的表達水平較正常對照組明顯升高(P＜0.01),而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,TNF-α、IL-1β、IL-4的表達水平較哮喘組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 7、Western blot檢測Kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表達及分析結(jié)果正常對照組肺組織有Kidin

17、s220的表達,且哮喘組Kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表達明顯高于正常對照組(P＜0.01或P＜0.05);而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體阻斷后,Kidins220、CrkL的表達較哮喘組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05);給與anti-ARMS抗體阻斷后,NGF、TrkA、CrkL的表達較哮喘組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 8、EMSA檢測肺組織NFrB結(jié)合活性及分析

18、結(jié)果哮喘組NFKB結(jié)合活性明顯高于正常對照組(P＜0.01),給予anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,NFκB結(jié)合活性較哮喘組明顯減少(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Kidins220在小鼠正常肺組織中有表達,且哮喘組明顯高于正常對照組,提示Kidins220可能參與了哮喘的發(fā)病。
　　 2、Kidins220阻斷后可以減輕哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應性,提示K

19、idins220參與哮喘氣道炎癥和氣道高反應性的發(fā)生。
　　 3、哮喘小鼠Kidins220、NGF、TrkA表達量增加,且Kidins220和TrkA共表達于細胞膜,而采用Kidins220抗體阻斷后,NGF、TrkA表達量減少。提示Kidins220可能通過NGF-TrkA途徑參與哮喘發(fā)病。
　　 4、哮喘小鼠NFκB被激活,引起炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4的過表達;Kidins220阻斷后,NFκB結(jié)合