神經(jīng)干細胞中PFK-1對神經(jīng)發(fā)生的負調(diào)控作用.pdf

1、神經(jīng)發(fā)生是指神經(jīng)干細胞經(jīng)歷增殖及不對稱分裂產(chǎn)生神經(jīng)前體細胞，并向不同的功能性區(qū)域遷移、分化，最終整合進入神經(jīng)環(huán)路中發(fā)揮生理功能的過程，也是成年大腦可塑性的意義所在。在成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)發(fā)生主要存在于兩個區(qū)域，即海馬齒狀回的顆粒細胞下層和側腦室的室管膜下區(qū)。側腦室室管膜下區(qū)的神經(jīng)前體細胞經(jīng)過增殖和分化，沿著嘴側遷移流以鏈式模式遷移至嗅球并分化成為中間神經(jīng)元;而海馬齒狀回下區(qū)的神經(jīng)干細胞則經(jīng)過短距離遷移至顆粒細胞下層分化為顆

2、粒細胞，并通過苔蘚纖維向海馬CA3區(qū)發(fā)出軸突投射，建立突觸聯(lián)系，最終整合到海馬神經(jīng)環(huán)路中發(fā)揮學習記憶等功能。由于海馬神經(jīng)發(fā)生與學習、記憶和情感等高級認知功能密切相關，因此關于該區(qū)域神經(jīng)發(fā)生及相關的分子機制在近些年來受到了廣泛的關注和研究。
　　磷酸果糖激酶-1(Phosphofructokinase-1，PFK-1)是糖酵解過程中重要的限速酶，主要通過磷酸化6-磷酸果糖生成ADP和1，6-雙磷酸果糖，在無氧狀態(tài)下為機體提供能量。以

3、往研究證實PFK-1和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關，并有望成為腫瘤治療的新靶點。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，PFK-1對星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元的功能也發(fā)揮著不同的作用。然而，關于PFK-1和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中另一個細胞群，神經(jīng)干細胞之間的聯(lián)系則迄今未見研究報道。
　　因此，本文展開了以下三方面的研究，第一:探究生理條件下，胚胎神經(jīng)干細胞中PFK-1是否參與對神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)，且該調(diào)節(jié)作用是通過何種途徑實現(xiàn)的;第二:探討缺氧后PFK-1的表達變化及其對

4、神經(jīng)發(fā)生的影響;第三:闡釋不同條件下PFK-1調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的分子機制。
　　本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 生理狀態(tài)下PFK-1對神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控作用
　　為了探究生理狀態(tài)下PFK-1對神經(jīng)干細胞生物學行為的影響，本研究構建了兩種慢病毒載體，分別攜帶PFK-1 shRNA和PFK-1基因全長以干擾和過表達PFK-1。將成功感染慢病毒的神經(jīng)干細胞貼壁分化，4天后取出進行β-Ⅲ-Tubulin（神經(jīng)元特異性標志

5、物）的免疫熒光標記。結果顯示，和LV-Control-shRNA組相比，LV-PFK-1-shRNA（干擾PFK-1表達）可顯著促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化水平，增加新生神經(jīng)元中多突起神經(jīng)元的比例;相反，LV-PFK-1-GFP（過表達PFK-1）則逆轉了這種神經(jīng)元分化水平的升高趨勢，多突起神經(jīng)元分化比例也明顯降低，這說明生理條件下，PFK-1是調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化及發(fā)育的重要分子。同時，結果顯示干擾PFK-1表達后，巢蛋白Nestin+（神

6、經(jīng)干細胞標志物）細胞比例顯著降低，增殖培養(yǎng)條件下的Nestin+細胞呈散在均勻的分布，而空病毒組細胞則趨向于呈神經(jīng)球樣聚集生長，這提示干擾神經(jīng)干細胞中PFK-1的表達不利于其干細胞樣特性的維持。以上結果證明，生理狀態(tài)下PFK-1可負調(diào)控神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化和樹突的發(fā)育，并參與干細胞樣特性的維持。
　　為了進一步證實PFK-1對神經(jīng)干細胞的調(diào)節(jié)作用，本研究通過立體定位向小鼠海馬齒狀回區(qū)(Dentate gyrus，DG)微量注射

7、慢病毒(LV-PFK-1-shRNA和LV-Control-shRNA)，第4天腹腔注射BrdU（5-bromo-2'-deoxyuridine）以標記新生細胞，第14天通過免疫熒光檢測GFP/BrdU/DCX的表達。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)和體外實驗結果一致，與LV-Control-shRNA相比，LV-PFK-1-shRNA可顯著升高GFP+/BrdU+/DCX+新生神經(jīng)元的比例，同時增加DG區(qū)GFP+/BrdU+新生細胞數(shù)。上述結果表明，體內(nèi)干

8、擾PFK-1表達可促進神經(jīng)前體細胞增殖，誘導神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元。
　　在以上整體動物實驗中，慢病毒非特異性的感染DG區(qū)所有細胞（包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞），可能對上述結果造成干擾。為了排除這種非細胞特異性感染帶來的影響，本文統(tǒng)計了未被病毒感染的神經(jīng)干細胞的神經(jīng)發(fā)生水平。結果顯示，GFP-/BrdU+/DCX+新生神經(jīng)元比例及GFP-/BrdU+新生細胞數(shù)在兩組間(LV-Control-shRNA和LV-PFK-1-shRNA)均無

9、顯著差異，提示這部分未被感染的神經(jīng)干細胞的功能并未受周圍因素（非細胞特異性的PFK-1干擾）的影響。因此可推斷，這種非細胞特異性的感染并不影響以上干擾PFK-1表達促進神經(jīng)發(fā)生的結果。
　　以上結果已證實干擾PFK-1表達可促進神經(jīng)發(fā)生，而引起神經(jīng)發(fā)生增強的因素可能有三種，第一:促進神經(jīng)元（前體細胞）的存活或降低其死亡率;第二:促進神經(jīng)前體細胞增殖;第三:誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。首先，為了確證干擾PFK-1表達所介導的神經(jīng)

10、發(fā)生是否通過作用于前兩種因素實現(xiàn)的，本文將成功轉染慢病毒（LV-Control-shRNA和LV-PFK-1-shRNA）的神經(jīng)干細胞進行貼壁分化，并摻入BrdU和Hoechst分別標記增殖和死亡的細胞。結果顯示和空病毒組相比，干擾PFK-1表達可顯著增加BrdU+細胞比例，對細胞死亡率并無顯著影響，說明干擾PFK-1表達可促進神經(jīng)前體細胞增殖，但對細胞存活并無改善作用。其次，通過引入數(shù)學描述的方法分析第三個因素，即干擾PFK-1表達對

11、神經(jīng)干細胞命運選擇的影響。假設分化過程中死亡的細胞全部都是神經(jīng)元或全都不是神經(jīng)元，可分別得到神經(jīng)前體細胞(β-Ⅲ-Tubulin-)向神經(jīng)元(β-Ⅲ-Tubulin+)分化的最小分化率（βmin）和最大分化率（βmax）。結果顯示，和LV-Control-shRNA組相比，分化第四天LV-PFK-1-shRNA組神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化率（βmin和βmax）均顯著升高。綜合以上結果可知，干擾PFK-1表達可通過促進神經(jīng)前體細胞增殖，誘

12、導神經(jīng)干細胞定向分化為神經(jīng)元而促進神經(jīng)發(fā)生，對細胞的存活并無顯著影響。
　　第二部分 缺氧狀態(tài)下PFK-1對神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控作用
　　本章研究主要探討缺氧后PFK-1的表達變化及該條件下PFK-1對神經(jīng)元分化水平的影響。結果顯示，缺氧3h、4h和5h后神經(jīng)干細胞中PFK-1的表達水平顯著升高，并具有一定的時間依賴性，說明缺氧可促進PFK-1表達。此后，將缺氧5h后的神經(jīng)干細胞繼續(xù)分化，4天后取出進行免疫熒光標記。結果顯示，和C

13、ontrol組相比，缺氧后β-Ⅲ-Tubulin的陽性細胞率并無顯著變化，這和生理條件下過表達PFK-1抑制神經(jīng)元分化的現(xiàn)象并不一致。經(jīng)分析可能是缺氧激活了某些調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的信號傳導通路，從而拮抗PFK-1升高對神經(jīng)元分化的抑制效應。此外，和空病毒組相比，缺氧狀態(tài)下干擾PFK-1表達后，β-Ⅲ-Tubulin陽性細胞比例顯著升高，新生神經(jīng)元中多突起神經(jīng)元的數(shù)目也明顯增加，這提示缺氧后干擾PFK-1可促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化和樹突的發(fā)

14、育;而過表達PFK-1則逆轉了這種現(xiàn)象。綜上所述，缺氧后PFK-1可反向調(diào)控神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，不利于神經(jīng)元的發(fā)育。
　　第三部分 PFK-1調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的分子機制
　　本章在細胞水平上初步研究了不同條件下PFK-1調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的分子機制。首先，通過Western blotting法檢測生理狀態(tài)下分化6h后神經(jīng)干細胞中Mash1、NeuroD和Sox2的蛋白表達水平。結果顯示，和LV-Control-shRNA相比，L

15、V-PFK-1-shRNA可顯著促進Mash1、NeuroD和Sox2的表達，而這種現(xiàn)象可被過表達PFK-1所逆轉，這提示Mash1、NeuroD和Sox2可能參與了PFK-1所介導的神經(jīng)發(fā)生過程。其次，對缺氧6h后的神經(jīng)干細胞進行Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，和生理狀態(tài)下一致，干擾PFK-1后Mash1、NeuroD和Sox2的蛋白表達水平均顯著升高，而過表達PFK-1則降低了以上三種轉錄因子的表達水平。以上實驗結果證明，

16、Mash1、NeuroD和Sox2可能參與了生理狀態(tài)下及缺氧后PFK-1對神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)過程。最后，本研究探討了PFK-1是否通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)上述轉錄因子，進而調(diào)控神經(jīng)發(fā)生，并最終證實PFK-1對神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)并不依賴于Wnt/β-catenin信號通路。
　　綜合以上結果可得到如下結論:(1)生理狀態(tài)下，PFK-1可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞的增殖及神經(jīng)干細胞的命運選擇而負調(diào)控神經(jīng)發(fā)生。(2)缺氧后，PFK-