自噬在系膜細(xì)胞氧化損傷與衰老中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：腎小球系膜細(xì)胞是腎臟重要的固有細(xì)胞之一，其衰老改變?cè)谀I臟衰老進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。但是，目前對(duì)于系膜細(xì)胞損傷衰老的機(jī)制還不清楚。研究影響系膜細(xì)胞衰老的因素，對(duì)于理解腎臟衰老機(jī)制及防治衰老相關(guān)腎臟疾病具有重要的意義。
　　自噬(autophagy)是細(xì)胞通過溶酶體對(duì)自身損傷、衰老的細(xì)胞器及生物大分子等進(jìn)行吞噬降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種保護(hù)機(jī)制。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬與衰老和人類疾病發(fā)生密切相關(guān)。但是目前對(duì)于自噬在系膜細(xì)胞氧化損傷

2、與衰老進(jìn)程中的作用及其機(jī)制還不清楚。
　　本研究擬用miR-34a、高糖、雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤(3-MA)分別處理年輕系膜細(xì)胞，通過抑制或增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能，觀察對(duì)細(xì)胞氧化損傷和衰老的影響，揭示自噬在系膜細(xì)胞損傷與衰老中的作用及機(jī)制。
　　方法：(1)從3月齡Spraque-Dawley(sD)大鼠腎臟分離培養(yǎng)原代系膜細(xì)胞，分別觀察第3代與第25代細(xì)胞自噬活性、氧化損傷及衰老相關(guān)指標(biāo)的變化：首先通過real-time定量P

3、CR檢測(cè)系膜細(xì)胞miR-34a的表達(dá)變化；用Western blot觀測(cè)自噬標(biāo)志物-自噬相關(guān)基因LC3、泛素結(jié)合蛋白p62/SQSTMI和多聚泛素聚集體(polyubiquitin aggregates)的表達(dá)變化；用硫代巴比妥酸法檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)損傷產(chǎn)物-丙二醛(MDA)水平，用2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)損傷產(chǎn)物-羰基(Carbonyl)含量，細(xì)胞免疫熒光染色觀察DNA損傷產(chǎn)物8-OHdG在細(xì)胞中的變化；通過進(jìn)行衰

4、老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色及衰老相關(guān)異染色質(zhì)斑塊(SAHF)分析檢測(cè)細(xì)胞的衰老程度。
　　(2)用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-34a可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行驗(yàn)證，然后將miR-34a表達(dá)質(zhì)粒和Atg9A shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠年輕的原代系膜細(xì)胞中，觀察對(duì)自噬基因、細(xì)胞自噬活性、細(xì)胞氧化損傷和衰老的影響。
　　(3)將大鼠年輕的系膜細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖組、高糖+雷帕霉素(自噬增

5、強(qiáng)劑)及高糖+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(自噬抑制劑)干預(yù)組。在細(xì)胞培養(yǎng)24h、72h及10d時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞自噬活性、細(xì)胞氧化損傷和衰老的變化。
　　結(jié)果：(1)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原代系膜細(xì)胞衰老過程中miR-34a表達(dá)水平增加，衰老系膜細(xì)胞中自噬體生成標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)下降、自噬體降解標(biāo)志物p62和多泛素聚集體表達(dá)升高；丙二醛、蛋白羰基的含量和細(xì)胞內(nèi)8-OHdG表達(dá)升高。
　　(2)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示Atg(自噬相關(guān)基因，auto

6、phagy-related gene)9A可能為miR-34a的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)miR-34a靶基因是Atg9A，并發(fā)現(xiàn)在衰老細(xì)胞中Atg9A蛋白表達(dá)下降；將miR-34a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到年輕系膜細(xì)胞中可使Atg9A蛋白表達(dá)下降，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)下降，p62/SQSTMI和多聚泛素聚集體表達(dá)升高，丙二醛及蛋白羰基含量上升，細(xì)胞內(nèi)8-OHdG表達(dá)升高，細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率升高，細(xì)胞內(nèi)異染色質(zhì)斑塊增多。將針對(duì)A

7、tg9A的shRNA(short hairpin RNAs，“短發(fā)夾”RNA)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到系膜細(xì)胞中以抑制Atg9A表達(dá)，結(jié)果出現(xiàn)與miR-34a過表達(dá)類似的細(xì)胞表型改變，進(jìn)一步證明miR-34a通過抑制自噬基因Atg9A表達(dá)，引起系膜細(xì)胞氧化損傷與衰老。
　　(3)我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)高糖處理72h和10d后，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)降低，p62/SQSTMI升高，MDA及羰基含量上升；處理72h細(xì)胞SA-β-ga

8、l染色陽性率增加，細(xì)胞核異染色質(zhì)斑塊形成增加。高糖培養(yǎng)的細(xì)胞用自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素干預(yù)72h和10d后LC3表達(dá)升高，p62/SQSTMI表達(dá)下降、MDA及蛋白質(zhì)羰基含量均下降，72h后細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率下降，細(xì)胞核異染色質(zhì)斑塊形成減少。高糖培養(yǎng)的細(xì)胞用自噬抑制劑3-MA干預(yù)72h和10d后，則可進(jìn)一步抑制細(xì)胞自噬活性，加重細(xì)胞的氧化損傷與衰老。
　　討論：(1)系膜細(xì)胞在衰老過程中自噬功能降低，氧化損傷水平增加。(2)

9、miR-34a可通過抑制自噬相關(guān)基因Atg9A表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷與衰老；抑制Atg9A表達(dá)可減弱細(xì)胞自噬功能，導(dǎo)致氧化損傷與衰老。(3)高糖可抑制系膜細(xì)胞自噬功能、引起系膜細(xì)胞氧化損傷和衰老；雷帕霉素干預(yù)可減輕高糖對(duì)系膜細(xì)胞自噬功能的抑制作用、減輕氧化損傷與衰老；3-MA可增加高糖對(duì)系膜細(xì)胞自噬功能的抑制作用、進(jìn)一步加重細(xì)胞氧化損傷與衰老。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在系膜細(xì)胞正常衰老過程中自噬功能降低，氧