三七皂苷對內(nèi)皮細胞MMP-活性、巨噬細胞炎癥因子表達及血小板凝集抑制作用的實驗研究.pdf

1、前言
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，嚴重危害人類健康。目前認為動脈粥樣硬化是由單核/淋巴細胞黏附并激活內(nèi)皮細胞而導(dǎo)致的一種慢性炎癥性疾病，動脈粥樣斑塊的形成過程是以低密度脂蛋白為主的各種脂質(zhì)成分在血管內(nèi)皮下聚集，繼而白細胞滲出、泡沫細胞形成、血管平滑肌增生以及大量結(jié)締組織形成的病理過程。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix m

2、etalloproteinases，MMPs)是一類含鋅的可降解細胞外基質(zhì)中多種蛋白成份的內(nèi)肽酶家族，其細胞來源極其豐富，可由正常組織細胞、炎癥細胞及腫瘤細胞產(chǎn)生，并且在許多生物活性物質(zhì)，如細胞因子、自由基和氧化型低密度脂蛋白等刺激下可異常表達，參與多種病理生理過程，如腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、炎癥、胚胎發(fā)育及血管再生等。MMPs參與AS斑塊的形成，并且由于其能降解細胞外基質(zhì)，削弱纖維帽對斑塊的保護作用，降低AS斑塊中脂質(zhì)含量而被認為是引發(fā)斑塊

3、破裂的最重要細胞因子。因此抑制MMPs的表達可以有效預(yù)防斑塊破裂，緩解動脈粥樣硬化。
　　 由于動脈粥樣硬化是血管壁的慢性炎癥性疾病，而細胞因子廣泛地參與了炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程，所以細胞因子在動脈粥樣硬化中具有重要的作用和意義。
　　 單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是單核/巨噬細胞特異的趨化性因子，其主要功能是趨化和激活單核/巨噬細胞至炎癥部位，參

4、與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫，并促進動脈粥樣硬化的形成。細胞白介素-6(Interleukin-6，IL-6)亦參與血管炎癥反應(yīng)，為促動脈粥樣硬化的因子。因此，抑制這兩種細胞因子的表達可以抑制動脈粥樣硬化病灶的形成。
　　 在AS斑塊形成和血脂紊亂的基礎(chǔ)上，常伴隨著血小板的異常激活。血小板參與了AS斑塊形成的全過程，即血小板本身有致斑塊性，血小板參與體內(nèi)血脂調(diào)節(jié)、促進炎癥及致氧化應(yīng)激作用。所以有效抑制血小板的活性可以減緩AS的發(fā)生與發(fā)展

5、。
　　 三七為五加科植物參三七的根，主產(chǎn)于云南、廣西等省。三七含有多種化學成分，其中三七總皂苷(toral saponins of panax notoginseng，PNS)為主要有效活性成分，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1為從中提純所得的單體皂苷。三七皂苷對心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有廣泛的作用，而且能抗腫瘤、抗衰老等，臨床上廣泛地應(yīng)用于心血管疾病、肝炎、外科疾病的治療。因此，三七是一味具有廣闊開發(fā)應(yīng)

6、用前景的藥物。但是其抗動脈粥樣硬化的具體機制研究較少，其單體成分人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1在治療動脈粥樣硬化中的作用尚不明確。
　　 本實驗中我們用Real time RT-PCR技術(shù)檢測不同濃度PNS，Rb1，Rg1對巨噬細胞分泌IL-6，MCP-1的影響；利用the microchip flowchamber system觀察不同濃度PNS，Rb1，Rg1對血小板凝集的影響；用明膠酶譜實驗觀察不同濃度PNS，Rb1，Rg

7、1對人臍靜脈內(nèi)皮細胞MMP-2活性的影響。進而探討三七皂苷在抗動脈粥樣硬化中的作用機制。
　　 實驗方法
　　 一、細胞培養(yǎng)
　　 (一)THP-1源性巨噬細胞的培養(yǎng)
　　 將THP-1細胞置于含10％FBS的PRMI1640培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞懸浮生長，在用PMA(50ng/ml)刺激貼壁分化為巨噬細胞后用于實驗。
　　 (二)人臍靜脈內(nèi)皮細胞的原

8、代分離與培養(yǎng)
　　 將取來的臍帶迅速移入潔凈操作臺內(nèi)，無菌條件下將其放入提前盛有預(yù)熱PBS培養(yǎng)皿中，剪去有鉗央痕及血腫的部分，擠出臍帶中的殘血，用剪刀修齊兩斷面。找出臍靜脈，用帶平針頭的注射器從一端插入臍靜脈，血管鉗固定，再用預(yù)熱的PBS沖洗3次發(fā)上，將血跡完全沖洗干凈。從沖洗的針頭中注入0.25％胰酶消化液使其充盈。取出針頭，用止血鉗央住注入端，移入無菌燒杯中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育7min。取出燒杯，松開注入端的血管鉗，收集

9、臍靜脈內(nèi)的消化液，然后注入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1000轉(zhuǎn)/min，離心6min，棄上清，加入DMEM完全培養(yǎng)液(含20％胎牛血清)，用巴氏吸管輕輕吹打均勻，3×104/cm2接種于培養(yǎng)皿，置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液去除未貼壁的細胞，然后每隔24h半定量換液1次至細胞生長鋪滿皿底。待細胞生長達亞融合狀態(tài)進行傳代，2代細胞用于實驗。
　　 二、R

10、eal time RT-PCR檢測巨噬細胞IL-15和MCP-1mRNA的表達
　　 收集待測巨噬細胞，進行RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄后按下列條件在熒光定量PCR儀上擴增：GAPDH：95℃10sec1Cycle；95℃10sec，61℃20sec，72℃30sec，45Cycle；IL-6:95℃10sec1Cycle；95℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，45Cycle；MCP-1:95℃10sec1Cycle；95

11、℃10sec，56.3℃20sec，72℃30sec，45Cycle；最后計算mRNA的相對表達量。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。
　　 三、體外血小板凝集試驗
　　 取人新鮮血液于含枸櫞酸鈉的試管中，混勻，再將血漿分裝至EP管(380μl/管)室溫靜置1小時。每管加入20μl用生理鹽水稀釋的PNS，Rg1，Rb1，使終濃度為：PNS濃度分別為0,200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml：Rb1濃度分別為0,50μg

12、/ml，200μg/ml，500μg/ml：Rg1濃度分別為0,50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml；上下?lián)u晃3次混勻，5分鐘后使用Themicrochipflowchambersystem檢測血小板凝集。
　　 四、明膠酶譜實驗測定人臍靜脈內(nèi)皮細胞中MMP-2的活性
　　 取對數(shù)生長期人臍靜脈內(nèi)皮細胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×105/ml，接種于24孔板，培養(yǎng)24h后去上清；加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)

13、培養(yǎng)24小時，使細胞生長同步化；再次吸出培養(yǎng)液，分別加入含有200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，PNS：50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml，Rb1及50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml，Rg1的無血清DMEM培養(yǎng)液，以不含三七皂苷的孔為對照組，每濃度平行3孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后取上清。上清按5:1與上樣緩沖液混合室溫放置10min，上樣于7.5％SDS-PAGE膠中，4℃，60mA恒流電

14、泳，待樣品達膠底端時電泳結(jié)束。電泳所得凝膠依次洗脫(30min，兩次)，孵育(37℃，20h)，用考馬斯亮藍染色4h，再脫色。凝膠圖像掃描入計算機后用ImageJ圖像處理軟件對條帶進行半定量分析。
　　 五、統(tǒng)計學分析
　　 各組實驗重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析和處理，實驗數(shù)據(jù)以x±S表示，統(tǒng)計方法采用Student’st-test和配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗

15、結(jié)果
　　 一、PNS，Rb1，Rg1對巨噬細胞炎癥因子IL-6，MCP-1表達的影響
　　 不同濃度的藥物作用THP-1分化成的巨噬細胞24小時后，RealtimeRT-PCR檢測巨噬細胞IL-6和MCP-1的mRNA相對表達量。結(jié)果顯示不同濃度的PNS和Rb1均可抑制LPS刺激后巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子IL-6，MCP-1mRNA的表達且呈濃度依賴效應(yīng)。而Rg1作用組與對照組沒有明顯差異。
　　 二、PNS，R

16、b1，Rg1對血小板凝集的影響
　　 藥物與新鮮血漿混合后，用The microchip flowchamber system檢測血小板凝集情況，得到血小板凝集時間及壓力曲線。
　　 PNS濃度為500μg/ml，1000μg/ml時可顯著延長血小板凝集時間，抑制血小板凝集，呈濃度依賴效應(yīng)。
　　 Rb1濃度為200μg/ml，500μg/ml時可顯著延長血小板凝集時間，抑制血小板凝集，呈濃度依賴效應(yīng)，且此種作用

17、強于PNS。
　　 Rg1作用組與對照組相比對血小板凝集均無影響。
　　 三、PNS，Rb1，Rg1對HUVEC分泌的MMP-2活性的影響
　　 明膠酶譜實驗檢測經(jīng)不同濃度PNS，Rb1，Rg1作用后，HUVEC細胞中MMP-2的活性。
　　 PNS濃度為500μg/ml及1000μg/ml時，MMP-2的活性較對照組減弱。
　　 Rb1各濃度作用于HUVEC24小時后MMP-2活性較對照組無明顯

18、差異。
　　 Rg1濃度為50μg/ml，200μg/ml，500μg/ml時作用于HUVEC24小時后MMP-2的活性較對照組減弱且呈濃度依賴效應(yīng)。
　　 結(jié)論
　　 1、PNS及其單體成分Rb1可以抑制由LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥因子IL-6及MCP-1mRNA的表達；Rg1對炎癥因子mRNA表達無抑制作用。
　　 2、PNS及其單體成分Rb1可以延長體外血小板凝集時間，抑制血小板凝集；Rg1對體外血小