miR155沉默促進人臍靜脈內皮細胞的凋亡及炎癥因子表達.pdf

1、本文從以下幾個方面進行論述。
　　第Ⅰ部分 原代臍靜脈內皮細胞的分離培養(yǎng)以及內皮細胞的miR155沉默
　　目的：探討人的原代臍靜脈內皮細胞的體外分離培養(yǎng)的方法并且鑒定其表型以及建立miR155在原代臍靜脈內皮細胞中被沉默的細胞模型。
　　方法：選擇對象為無高血壓、糖尿病等疾病的待產孕婦，生產時取其足月產胎兒臍帶一條，將其置于裝有4℃預冷生理鹽水的50ml離心管中，在超凈臺中將臍帶移入培養(yǎng)瓶中，用含有肝素的生理鹽水沖洗

2、3次，直到臍帶變?yōu)橥该魅榘咨?，將II型膠原酶用注射器注射入臍帶中進行消化，并且將一整套臍帶與尿袋的連接裝置放在37℃溫箱中消化30min后拿出來，加入含有10％左右的高級澳洲胚胎牛血清的內皮細胞專用培養(yǎng)基（ECM）進行細胞培養(yǎng)并且待細胞長至培養(yǎng)板80％時傳代，取2~4代細胞作為干預及轉染用。根據Genbank中人的miRNA155基因信息，由上海生物工程公司合成基因序列，將所得序列的互補序列酶切后鑒定。將擴增片段與病毒載體連接，并將該

3、復合體轉化進入感受態(tài)的大腸桿菌，增長出克隆后經過基因測序得出堿基排列順序或者進行PCR鑒定克隆結果是否為所要求范圍內的基因片段。
　　結果：從普通光學顯微鏡下觀測臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的外形特征，并且經過vWF免疫熒光染色證明從臍帶中消化出來的細胞符合內皮細胞的形態(tài)特征及免疫學熒光表現(xiàn)。將包裝好的病毒載體進行基因測序，檢測酶切重組后的序列是否為所需的序列，經證實重組序列為目的序列。
　　結論：HUVECs的分離與培養(yǎng)

4、以及miR155在HUVECs中沉默的體外模型的構建，為miR155在內皮中的作用提供了一個研究的基礎。
　　第Ⅱ部分 miRNA155沉默后臍靜脈內皮細胞炎癥因子的表達及凋亡的改變
　　目的：觀察miR155沉默后對臍靜脈內皮細胞由ox-LDL誘導的炎癥因子的表達及內皮細胞凋亡的影響。
　　方法：用ox-LDL誘導臍靜脈內皮細胞凋亡以及炎癥因子的表達，通過Tunel分別檢測內皮細胞0h、24h、48h時的凋亡率，用I

5、PP6.0軟件計數(shù)凋亡細胞，通過對比觀察miR155沉默組的細胞凋亡率的改變。Western blot，RT-PCR分別測量ICAM-1，VCAM-1在蛋白質水平與信使RNA（mRNA）水平的表達。高遷移速率電泳（EMSA）檢驗NFκB與相應DNA結合的轉錄活性。
　　結果：ox-LDL刺激內皮細胞構建的細胞凋亡以及相關下游的炎癥因子表達的體外模型中，miR155沉默組的VCAM-1，ICAM-1的蛋白以及mRNA的表達程度明顯高

6、于正常組（Control組），NFκB與相應DNA結合的轉錄活性明顯提高。凋亡的計數(shù)沉默組高于正常組與空白病毒對照組。
　　結論：建立臍靜脈內皮細胞miR155沉默的體外細胞模型，實驗結果提示HUVECs中miR155沉默后內皮細胞48h內凋亡率明顯增加并且ox-LDL誘導的ICAM-1、VCAM-1相關炎癥因子的表達增加，進一步檢測NFκB在24h的DNA結合活性提示轉染組明顯提高，這些均說明miR155在HUVECs的凋亡以及