miR155沉默促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及炎癥因子表達(dá).pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第Ⅰ部分 原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及內(nèi)皮細(xì)胞的miR155沉默
　　目的：探討人的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)的方法并且鑒定其表型以及建立miR155在原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中被沉默的細(xì)胞模型。
　　方法：選擇對(duì)象為無(wú)高血壓、糖尿病等疾病的待產(chǎn)孕婦，生產(chǎn)時(shí)取其足月產(chǎn)胎兒臍帶一條，將其置于裝有4℃預(yù)冷生理鹽水的50ml離心管中，在超凈臺(tái)中將臍帶移入培養(yǎng)瓶中，用含有肝素的生理鹽水沖洗

2、3次，直到臍帶變?yōu)橥该魅榘咨?，將II型膠原酶用注射器注射入臍帶中進(jìn)行消化，并且將一整套臍帶與尿袋的連接裝置放在37℃溫箱中消化30min后拿出來(lái)，加入含有10％左右的高級(jí)澳洲胚胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（ECM）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并且待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)板80％時(shí)傳代，取2~4代細(xì)胞作為干預(yù)及轉(zhuǎn)染用。根據(jù)Genbank中人的miRNA155基因信息，由上海生物工程公司合成基因序列，將所得序列的互補(bǔ)序列酶切后鑒定。將擴(kuò)增片段與病毒載體連接，并將該

3、復(fù)合體轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌，增長(zhǎng)出克隆后經(jīng)過(guò)基因測(cè)序得出堿基排列順序或者進(jìn)行PCR鑒定克隆結(jié)果是否為所要求范圍內(nèi)的基因片段。
　　結(jié)果：從普通光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的外形特征，并且經(jīng)過(guò)vWF免疫熒光染色證明從臍帶中消化出來(lái)的細(xì)胞符合內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征及免疫學(xué)熒光表現(xiàn)。將包裝好的病毒載體進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)酶切重組后的序列是否為所需的序列，經(jīng)證實(shí)重組序列為目的序列。
　　結(jié)論：HUVECs的分離與培養(yǎng)

4、以及miR155在HUVECs中沉默的體外模型的構(gòu)建，為miR155在內(nèi)皮中的作用提供了一個(gè)研究的基礎(chǔ)。
　　第Ⅱ部分 miRNA155沉默后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)及凋亡的改變
　　目的：觀察miR155沉默后對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：用ox-LDL誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及炎癥因子的表達(dá)，通過(guò)Tunel分別檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞0h、24h、48h時(shí)的凋亡率，用I

5、PP6.0軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，通過(guò)對(duì)比觀察miR155沉默組的細(xì)胞凋亡率的改變。Western blot，RT-PCR分別測(cè)量ICAM-1，VCAM-1在蛋白質(zhì)水平與信使RNA（mRNA）水平的表達(dá)。高遷移速率電泳（EMSA）檢驗(yàn)NFκB與相應(yīng)DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞凋亡以及相關(guān)下游的炎癥因子表達(dá)的體外模型中，miR155沉默組的VCAM-1，ICAM-1的蛋白以及mRNA的表達(dá)程度明顯高

6、于正常組（Control組），NFκB與相應(yīng)DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄活性明顯提高。凋亡的計(jì)數(shù)沉默組高于正常組與空白病毒對(duì)照組。
　　結(jié)論：建立臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞miR155沉默的體外細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HUVECs中miR155沉默后內(nèi)皮細(xì)胞48h內(nèi)凋亡率明顯增加并且ox-LDL誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1相關(guān)炎癥因子的表達(dá)增加，進(jìn)一步檢測(cè)NFκB在24h的DNA結(jié)合活性提示轉(zhuǎn)染組明顯提高，這些均說(shuō)明miR155在HUVECs的凋亡以及