舌癌患者自體CIK細胞的體外培養(yǎng)及其免疫活性的研究.pdf

1、過去幾十余年腫瘤免疫研究取得很大成就，已初步闡明腫瘤免疫的主要機制，為各項研究的深入開展創(chuàng)造了條件。在這段時間里，先后發(fā)現(xiàn)了多種具有抗腫瘤活性的效應細胞，如LAK、TIL、CIL等。但這些效應細胞都有各自的局限性，LAK細胞抗腫瘤活性的維持依賴于高濃度外源性IL-2，臨床應用受到一定限制。TIL和CIL雖然對腫瘤有特異性殺傷作用，但能活得的細胞數(shù)量有限。CIK屬新型有高度體外擴增能力非MHC限制性的腫瘤效應細胞，已有實驗證明CIK比其他

2、類型免疫細胞有更強的抗腫瘤活性，對多種腫瘤類型均有殺傷作用，具有廣闊的臨床應用前景。鱗狀細胞癌是頭頸部惡性腫瘤中最常見的組織類型。統(tǒng)計資料顯示，在我國，舌癌占口腔癌構(gòu)成比的30％-50％，發(fā)病率為0.4-0.6/10萬，每年都有大量的新增病例。舌鱗癌具有獨特的生物學行為，腫瘤侵襲能力強，容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。中晚期舌癌治療的難度大，臨床強調(diào)采用綜合治療，除了手術(shù)、放療和化療以外，腫瘤的生物治療日益受到重視，與舌癌有關(guān)的細胞免疫研究正逐步開

3、展。本實驗將初步探討舌癌患者自體CIK細胞對人舌癌細胞系Tca8113的抗腫瘤活性。 目的： ①分別探討舌癌患者及正常人外周血CIK細胞的增殖能力、細胞表型、和對Tca8113細胞的細胞毒作用。 ②觀察CIK細胞體外誘導培養(yǎng)過程中分泌的細胞因子白細胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)等含量的變化。 ③研究舌癌患者LAK細胞、CD3AK細胞增殖能力、和對Tca81

4、13細胞的細胞毒作用并與舌癌患者自體CIK細胞作比較。 ④為尋求舌癌患者自體CIK細胞對舌癌過繼免疫治療的新途徑提供實驗依據(jù)。 方法： 提取20例舌癌患者和20例健康捐獻者的外周血，經(jīng)密度梯度離心分離外周血單核細胞，即提取外周血單核細胞中非貼壁細胞用含10％人AB型血清的RPM11640懸浮細胞，加入IFN-γ，培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗CD3mAb包被的培養(yǎng)瓶，加入IL-2和IL-1βB共同培養(yǎng)誘導CIK細胞，定

5、期換液，培養(yǎng)過程中進行細胞形態(tài)觀察和細胞計數(shù)，了解細胞擴增能力； ①流式細胞儀檢測CIK細胞動態(tài)表型特征，用MTT法檢測各效應細胞對舌鱗癌細胞系Tca8113的殺傷活性； ②分別取不同時段CIK細胞的培養(yǎng)上清液0.5ml，用酶聯(lián)免疫的方法檢測其培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、TNF-α的含量變化； ③同時培養(yǎng)舌癌患者LAK細胞、CD3AK細胞并與舌癌患者CIK細胞在增殖能力和對Tca8113殺傷活性上作比較。資

6、料用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 舌癌患者20ml外周血經(jīng)過一個周期培養(yǎng)平均獲得的CIK細胞數(shù)低于健康對照組(P<0.05)，但舌癌患者CIK細胞經(jīng)過周期培養(yǎng)也較培養(yǎng)前的數(shù)量明顯增高，于12-21d達高峰。 ① CIK細胞培養(yǎng)過程中其上清液IL-2、TNF-α、INF-γ含量隨時間增長而升高，至2周左右達最高峰，隨后有下降趨勢，表明CIK細胞在培養(yǎng)過程中其自身可以分

7、泌多種具有抗腫瘤作用的細胞因子，從而間接反映CIK細胞在體外培養(yǎng)2周左右具有較大生物學活性；②舌癌患者CIK細胞與同體來源的LAK細胞相比細胞增殖倍數(shù)和殺傷活性均明顯提高(P<0.05)。舌癌患者CIK細胞與舌癌患者CD3AK相比細胞增殖倍數(shù)早期無明顯差異但后期增殖倍數(shù)及殺傷活性有顯著提高(P<0.05)。 結(jié)論： 人舌癌患者外周血懸浮生長的單核細胞經(jīng)IFN-γ、抗CD3mAb、IL-2和IL-1β等細胞因子序列誘導后可

8、大量擴增富含CD3+CD56+雙陽性細胞的CIK異質(zhì)細胞群，培養(yǎng)后明顯提高CIK細胞中CD3+CD56+雙陽性細胞的比例(P<0.05)，CD3+、CD3+CD8+細胞也較培養(yǎng)前顯著增加(P<0.05)，而CD3+CD4+和CD3-CDs6+的百分率則明顯下降。 ①CIK細胞可分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子，且在培養(yǎng)2周左右時量最大，提示此時CIK細胞具有較大生物學活性，實驗結(jié)果提示CIK細胞可能通過其自身分泌I