hTERT 1540-PTD融合基因疫苗誘發(fā)抗腫瘤免疫力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)是指利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用域?qū)⑴c之共價(jià)結(jié)合的化合物、肽、反義肽核酸或與之融合表達(dá)的全長蛋白質(zhì)通過非受體依賴、非轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴方式運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)的一種技術(shù)。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用不是通過全長蛋白發(fā)生的，而是依賴于長約10～16個(gè)氨基酸殘基的富含堿性氨基酸殘基的在生理pH值條件下帶凈正電荷的氨基酸序列，該序列即被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用域。最近研究表明蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)不僅可顯著提高藥物進(jìn)入細(xì)胞的效率，而且可作為腫瘤基因治療的輔助手段來提高對腫瘤組織的殺

2、傷效率，更被用來引導(dǎo)特定抗原進(jìn)入MHCⅠ類分子依賴的抗原提呈途徑并能顯著增強(qiáng)腫瘤多肽疫苗和基因疫苗的免疫效能，然而目前尚無研究闡明蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力與其對基因疫苗免疫效能的增強(qiáng)能力之間的相互關(guān)系。 目的自行設(shè)計(jì)并制備重組腺病毒介導(dǎo)的、針對hTERTI540表位的基因疫苗并對其體外加載樹突狀細(xì)胞后誘發(fā)抗腫瘤免疫的能力進(jìn)行評價(jià)，比較具有不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域?qū)φT發(fā)抗腫瘤免疫力的影響。 方法和結(jié)果1、根據(jù)hTE

3、RTI540表位、HIV-1TAT-PTD和人工合成的PTD4的氨基酸序列，設(shè)計(jì)I540-PTD和I540-PTD4并根據(jù)人類偏愛密碼子反翻譯(back-translation)為基因序列，摻入kozak序列，獲得真核表達(dá)讀框。設(shè)計(jì)6條寡聚脫氧核糖核苷酸鏈，經(jīng)磷酸化、退火并連接后克隆至pSP72載體，獲得pSP72-I540-PTD和pSP72-I540-PTD4。雙酶切鑒定和DNA測序均證實(shí)成功獲得I540-PTD和I540-PTD4

4、真核表達(dá)讀框。 2、將I540-PTD和I540-PTD4真核表達(dá)讀框亞克隆至穿梭質(zhì)粒pDC315，經(jīng)雙酶切鑒定獲得pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4。將pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4與主干質(zhì)粒pBHGloxdeltaE13Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，10天后可見典型的細(xì)胞病變反應(yīng)，收獲細(xì)胞，制備病毒粗提液，經(jīng)擴(kuò)增和純化獲得重組復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-I540-PT

5、D和Ad-I540-PTD4。使用終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)和空斑形成實(shí)驗(yàn)測定純化后病毒滴度。Ad-I540-PTD的滴度分別為8.9×109pfu/ml和6.3×109pfu/ml，Ad-I540-PTD4的滴度分別為5.8×109pfu/ml和5.4×10pfu/ml9。自行設(shè)計(jì)引物，對Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4進(jìn)行PCR鑒定，成功獲得167bp目標(biāo)片斷。使用抗組胺酸標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ad-I540-PTD和Ad

6、-I540-PTD4轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞均呈強(qiáng)染，證實(shí)Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4中攜帶的I540-PTD和I540-PTD4真核表達(dá)讀框可在人類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 3、使用HLA-A*0201+人外周血分離純化單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF和IL-4作用下分化為樹突狀細(xì)胞，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后光鏡和電鏡觀察均可見典型成熟樹突狀細(xì)胞形態(tài)。 4、使用MTT法測定PBMC、樹突狀細(xì)胞(DC)、經(jīng)Ad-I540-PTD轉(zhuǎn)

7、染的樹突狀細(xì)胞(PTD-DC)和經(jīng)Ad-I540-PTD4轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞(PTD4-DC)刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖的能力發(fā)現(xiàn)PBMC和未轉(zhuǎn)染DC對自體T細(xì)胞均有低水平的增殖刺激能力，而PTD-DC組和PTD4-DC組在各濃度的刺激指數(shù)均顯著高于PBMC組和DC組(t檢驗(yàn)，P＜0.01)，在樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞比為1：10時(shí)可分別達(dá)到11.75±0.26和12.17±0.46。同時(shí)PTD-DC組和PTD4-DC組在各濃度的SI相比沒有顯著差

8、異(t檢驗(yàn)，P＞0.05)。 5、分別使用hTERT+HLA-A*0201+的MCF-7細(xì)胞和hTERT-HLA-A*0201-的U2OS細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，用ELISA法測定效靶比為50：1時(shí)山PBMC、DC、PTD-DC和PTD4-DC致敏的T淋巴細(xì)胞釋放TNF-α能力。經(jīng)致敏的CTL在沒有刺激細(xì)胞存在時(shí)僅有低水平的TNF-α釋放，而當(dāng)使用MCF-7和U2OS作為刺激細(xì)胞時(shí)釋放的TNF-α水平顯著增高，以PTD-DC和PTD4

9、-DC致敏的T淋巴細(xì)胞組(PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組)更為顯著(t檢驗(yàn)，P＜0.01)。然而在PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組使用U2OS刺激TNF-α釋放濃度分別為35.6±2.9pg/ml和31.9±3.1pg/ml，顯著低于使用MCF-7時(shí)的80.9±3.8pg/ml和84.3±3.5pg/ml(t檢驗(yàn)，P＜0.01)。 6、以hTERT+HLA-A*0201+的MCF-7作為靶細(xì)胞，測定不同效靶比時(shí)

10、各組的特異性殺傷效應(yīng)。與PBMC-L組和DC-L組相比，PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組對MCF-7有較強(qiáng)的殺傷作用(t檢驗(yàn)，P＜0.01)，殺傷效應(yīng)隨效靶比升高而增強(qiáng)，當(dāng)效靶比為100：1時(shí)特異性殺傷率可分別達(dá)到75.7±4.1％和79.3±3.7％。然而PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組對MCF-7的殺傷能力在各效靶比時(shí)均沒有顯著差異(t檢驗(yàn)，P＞0.05)。 結(jié)論1、設(shè)計(jì)并構(gòu)建了攜帶I540-PTD和I540

11、-PTD4融合基因表達(dá)框的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4。 2、Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4體外轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞后可誘發(fā)高水平的hTERT特異性抗腫瘤免疫，提示HIV-1TAT-PTD和PTD4均可用于制備高效腫瘤基因疫苗。同時(shí)Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4可以exvivo方式廣泛用于為HLA-A*0201+hTERT+惡性腫瘤患者的免疫治療。 3