hTERT 1540-PTD融合基因疫苗誘發(fā)抗腫瘤免疫力的實驗研究.pdf

1、研究背景蛋白轉(zhuǎn)導技術是指利用蛋白轉(zhuǎn)導作用域?qū)⑴c之共價結(jié)合的化合物、肽、反義肽核酸或與之融合表達的全長蛋白質(zhì)通過非受體依賴、非轉(zhuǎn)運蛋白依賴方式運送至細胞內(nèi)的一種技術。蛋白轉(zhuǎn)導作用不是通過全長蛋白發(fā)生的，而是依賴于長約10～16個氨基酸殘基的富含堿性氨基酸殘基的在生理pH值條件下帶凈正電荷的氨基酸序列，該序列即被稱為蛋白轉(zhuǎn)導作用域。最近研究表明蛋白轉(zhuǎn)導技術不僅可顯著提高藥物進入細胞的效率，而且可作為腫瘤基因治療的輔助手段來提高對腫瘤組織的殺

2、傷效率，更被用來引導特定抗原進入MHCⅠ類分子依賴的抗原提呈途徑并能顯著增強腫瘤多肽疫苗和基因疫苗的免疫效能，然而目前尚無研究闡明蛋白轉(zhuǎn)導功能域的轉(zhuǎn)導能力與其對基因疫苗免疫效能的增強能力之間的相互關系。 目的自行設計并制備重組腺病毒介導的、針對hTERTI540表位的基因疫苗并對其體外加載樹突狀細胞后誘發(fā)抗腫瘤免疫的能力進行評價，比較具有不同蛋白轉(zhuǎn)導能力的蛋白轉(zhuǎn)導功能域?qū)φT發(fā)抗腫瘤免疫力的影響。 方法和結(jié)果1、根據(jù)hTE

3、RTI540表位、HIV-1TAT-PTD和人工合成的PTD4的氨基酸序列，設計I540-PTD和I540-PTD4并根據(jù)人類偏愛密碼子反翻譯(back-translation)為基因序列，摻入kozak序列，獲得真核表達讀框。設計6條寡聚脫氧核糖核苷酸鏈，經(jīng)磷酸化、退火并連接后克隆至pSP72載體，獲得pSP72-I540-PTD和pSP72-I540-PTD4。雙酶切鑒定和DNA測序均證實成功獲得I540-PTD和I540-PTD4

4、真核表達讀框。 2、將I540-PTD和I540-PTD4真核表達讀框亞克隆至穿梭質(zhì)粒pDC315，經(jīng)雙酶切鑒定獲得pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4。將pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4與主干質(zhì)粒pBHGloxdeltaE13Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，10天后可見典型的細胞病變反應，收獲細胞，制備病毒粗提液，經(jīng)擴增和純化獲得重組復制缺陷型腺病毒Ad-I540-PT

5、D和Ad-I540-PTD4。使用終點稀釋實驗和空斑形成實驗測定純化后病毒滴度。Ad-I540-PTD的滴度分別為8.9×109pfu/ml和6.3×109pfu/ml，Ad-I540-PTD4的滴度分別為5.8×109pfu/ml和5.4×10pfu/ml9。自行設計引物，對Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4進行PCR鑒定，成功獲得167bp目標片斷。使用抗組胺酸標簽抗體進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ad-I540-PTD和Ad

6、-I540-PTD4轉(zhuǎn)染的U2OS細胞均呈強染，證實Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4中攜帶的I540-PTD和I540-PTD4真核表達讀框可在人類細胞內(nèi)表達。 3、使用HLA-A*0201+人外周血分離純化單個核細胞，經(jīng)GM-CSF和IL-4作用下分化為樹突狀細胞，經(jīng)TNF-α誘導后光鏡和電鏡觀察均可見典型成熟樹突狀細胞形態(tài)。 4、使用MTT法測定PBMC、樹突狀細胞(DC)、經(jīng)Ad-I540-PTD轉(zhuǎn)

7、染的樹突狀細胞(PTD-DC)和經(jīng)Ad-I540-PTD4轉(zhuǎn)染的樹突狀細胞(PTD4-DC)刺激自體T淋巴細胞增殖的能力發(fā)現(xiàn)PBMC和未轉(zhuǎn)染DC對自體T細胞均有低水平的增殖刺激能力，而PTD-DC組和PTD4-DC組在各濃度的刺激指數(shù)均顯著高于PBMC組和DC組(t檢驗，P＜0.01)，在樹突狀細胞和T細胞比為1：10時可分別達到11.75±0.26和12.17±0.46。同時PTD-DC組和PTD4-DC組在各濃度的SI相比沒有顯著差

8、異(t檢驗，P＞0.05)。 5、分別使用hTERT+HLA-A*0201+的MCF-7細胞和hTERT-HLA-A*0201-的U2OS細胞作為刺激細胞，用ELISA法測定效靶比為50：1時山PBMC、DC、PTD-DC和PTD4-DC致敏的T淋巴細胞釋放TNF-α能力。經(jīng)致敏的CTL在沒有刺激細胞存在時僅有低水平的TNF-α釋放，而當使用MCF-7和U2OS作為刺激細胞時釋放的TNF-α水平顯著增高，以PTD-DC和PTD4

9、-DC致敏的T淋巴細胞組(PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組)更為顯著(t檢驗，P＜0.01)。然而在PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組使用U2OS刺激TNF-α釋放濃度分別為35.6±2.9pg/ml和31.9±3.1pg/ml，顯著低于使用MCF-7時的80.9±3.8pg/ml和84.3±3.5pg/ml(t檢驗，P＜0.01)。 6、以hTERT+HLA-A*0201+的MCF-7作為靶細胞，測定不同效靶比時

10、各組的特異性殺傷效應。與PBMC-L組和DC-L組相比，PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組對MCF-7有較強的殺傷作用(t檢驗，P＜0.01)，殺傷效應隨效靶比升高而增強，當效靶比為100：1時特異性殺傷率可分別達到75.7±4.1％和79.3±3.7％。然而PTD-DC-L組和PTD4-DC-L組對MCF-7的殺傷能力在各效靶比時均沒有顯著差異(t檢驗，P＞0.05)。 結(jié)論1、設計并構(gòu)建了攜帶I540-PTD和I540

11、-PTD4融合基因表達框的復制缺陷型重組腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4。 2、Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4體外轉(zhuǎn)染樹突狀細胞后可誘發(fā)高水平的hTERT特異性抗腫瘤免疫，提示HIV-1TAT-PTD和PTD4均可用于制備高效腫瘤基因疫苗。同時Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4可以exvivo方式廣泛用于為HLA-A*0201+hTERT+惡性腫瘤患者的免疫治療。 3