siRN沉默Bcl-2表達增強人食管癌EC9706細胞放射敏感性的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，病死率高達90％，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第四。食管癌的形成是一個非常復(fù)雜的過程，是細胞生長與增殖的調(diào)控發(fā)生嚴重紊亂的結(jié)果。目前研究表明多種凋亡相關(guān)基因在食管癌發(fā)生與發(fā)展的過程中起著重要的調(diào)控作用。放射治療是臨床上治療腫瘤的一種重要手段，腫瘤細胞的放射敏感性與DNA損傷修復(fù)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、凋亡以及細胞周期調(diào)控等最基本的生命活動密切相關(guān)。近年來隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的進步，我

2、們可以對腫瘤細胞的某些信號通路中的關(guān)鍵分子進行阻斷、導(dǎo)入和修飾等，促進電離輻射所誘發(fā)的腫瘤細胞死亡和凋亡，進一步提高放射治療的有效性，并最大限度地降低正常組織細胞損傷的方法已成為腫瘤放射治療研究的熱點之一。
　　 Bcl—2(B—cell Leukemia2)蛋白家族是線粒體凋亡途徑中重要的凋亡調(diào)節(jié)者，其包括兩大亞家族：1、抑凋亡成員：存在于細胞內(nèi)的線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等部位，包括Bcl-2、Bcl—W、Bcl-XL、mcl—

3、1等，2、促凋亡成員：正常時存在于細胞質(zhì)或細胞骨架，包括Bcl-xs、Bax、Bak、Bad、Hrk和Bim等。這兩類物質(zhì)相互結(jié)合、彼此抑制，凋亡的發(fā)生與否往往由其數(shù)量的相對多少來控制。在Bcl—2家族中Bcl-2蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)，而且到目前為止研究的較為透徹的家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl—2蛋白存在于細胞內(nèi)的線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，具有離子通道(ion channel)和?？康鞍?docking protein)的雙重功能，在介導(dǎo)細

4、胞凋亡的通路中起著非常關(guān)鍵的作用。在線粒體凋亡途徑中Bcl—2蛋白一方面可直接改變線粒體膜的通透性，另一方面又可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+，通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+參與的膜通透性轉(zhuǎn)換(PT)來穩(wěn)定線粒體膜，從而阻止細胞色素C從線粒體釋放，再通過與Apaf—1、procaspase—9的相互作用，最終抑制Caspase—9、Caspase—3觸發(fā)的細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程。
　　 目前研究認為腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的重要原因之一是抑制細胞

5、凋亡的Bcl—2基因及其相關(guān)蛋白的高表達。因此利用RNA干擾技術(shù)，通過抑制Bcl—2基因的表達來促進腫瘤細胞的凋亡，是目前正在積極探索的一條新的腫瘤治療途徑。
　　 RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)引起的特異性基因沉默現(xiàn)象，引發(fā)RNAi的雙鏈RNA被稱為siRNA。在細胞內(nèi)，siRNA通過堿基互補識別并結(jié)合相應(yīng)的靶mRNA鏈，引導(dǎo)核酸酶對此mRNA鏈切割、消化，最終導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默。新近研究表明，將體外人工合成的

6、siRNA導(dǎo)入細胞后，也可特異性抑制相應(yīng)基因的表達。本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將凋亡抑制基因Bcl—2的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至人食管癌EC9706細胞中，特異性阻斷Bcl—2基因的表達，聯(lián)合X射線照射，觀察RNA干擾聯(lián)合放射對細胞增殖、凋亡的影響，以及RNA干擾的放射增敏作用，為探索新的食管癌治療方法提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1．3對靶向Bcl—2基因的siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并化學(xué)合成。<

7、br>　　 2．脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染人食管癌細胞株EC9706，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后EC9706細胞中Bcl—2蛋白的表達。
　　 3．AnnexinV—FITC/PI雙染凋亡試劑盒檢測不同實驗組EC9706細胞凋亡率，觀察轉(zhuǎn)染siRNA對細胞凋亡的影響。
　　 4．AnnexinV—FITC/PI雙染凋亡試劑盒檢測siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合X射線照射對細胞凋亡的影響。
　　 5．平板克隆形成實驗觀察Bcl—2特異

8、性干擾siRNA對細胞放射敏感性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)可以將Bcl—2—siRNA成功導(dǎo)入人食管癌細胞EC9706。
　　 2．流式細胞儀檢測結(jié)果證實Bcl—2—siRNA轉(zhuǎn)染引起EC9707細胞中Bcl—2蛋白表達下調(diào)。
　　 3．與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組及空白對照組相比，Bcl—2—siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率明顯增加，說明Bcl—2—siRNA可誘導(dǎo)人食管癌細胞EC970

9、6凋亡。
　　 4．Bcl—2 siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合X射線照射明顯增加人食管癌細胞EC9706的凋亡率。
　　 5．克隆形成實驗表明，與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組及空白對照組相比，Bcl—2—siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞存活曲線明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 凋亡抑制基因Bcl—2特異性siRNA導(dǎo)入人食管癌EC9706細胞可以抑制Bcl—2蛋白在細胞中的表達，誘導(dǎo)EC9706細胞凋亡，增強食管癌細胞對X射線照射的敏感