siRN沉默Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 食管癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，病死率高達(dá)90％，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第四。食管癌的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，是細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂的結(jié)果。目前研究表明多種凋亡相關(guān)基因在食管癌發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。放射治療是臨床上治療腫瘤的一種重要手段，腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期調(diào)控等最基本的生命活動(dòng)密切相關(guān)。近年來(lái)隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，我

2、們可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的某些信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行阻斷、導(dǎo)入和修飾等，促進(jìn)電離輻射所誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞死亡和凋亡，進(jìn)一步提高放射治療的有效性，并最大限度地降低正常組織細(xì)胞損傷的方法已成為腫瘤放射治療研究的熱點(diǎn)之一。
　　 Bcl—2(B—cell Leukemia2)蛋白家族是線粒體凋亡途徑中重要的凋亡調(diào)節(jié)者，其包括兩大亞家族：1、抑凋亡成員：存在于細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等部位，包括Bcl-2、Bcl—W、Bcl-XL、mcl—

3、1等，2、促凋亡成員：正常時(shí)存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞骨架，包括Bcl-xs、Bax、Bak、Bad、Hrk和Bim等。這兩類(lèi)物質(zhì)相互結(jié)合、彼此抑制，凋亡的發(fā)生與否往往由其數(shù)量的相對(duì)多少來(lái)控制。在Bcl—2家族中Bcl-2蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)，而且到目前為止研究的較為透徹的家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl—2蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，具有離子通道(ion channel)和停靠蛋白(docking protein)的雙重功能，在介導(dǎo)細(xì)

4、胞凋亡的通路中起著非常關(guān)鍵的作用。在線粒體凋亡途徑中Bcl—2蛋白一方面可直接改變線粒體膜的通透性，另一方面又可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+，通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+參與的膜通透性轉(zhuǎn)換(PT)來(lái)穩(wěn)定線粒體膜，從而阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放，再通過(guò)與Apaf—1、procaspase—9的相互作用，最終抑制Caspase—9、Caspase—3觸發(fā)的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。
　　 目前研究認(rèn)為腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的重要原因之一是抑制細(xì)胞

5、凋亡的Bcl—2基因及其相關(guān)蛋白的高表達(dá)。因此利用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)抑制Bcl—2基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，是目前正在積極探索的一條新的腫瘤治療途徑。
　　 RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)引起的特異性基因沉默現(xiàn)象，引發(fā)RNAi的雙鏈RNA被稱(chēng)為siRNA。在細(xì)胞內(nèi)，siRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的靶mRNA鏈，引導(dǎo)核酸酶對(duì)此mRNA鏈切割、消化，最終導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默。新近研究表明，將體外人工合成的

6、siRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，也可特異性抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將凋亡抑制基因Bcl—2的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至人食管癌EC9706細(xì)胞中，特異性阻斷Bcl—2基因的表達(dá)，聯(lián)合X射線照射，觀察RNA干擾聯(lián)合放射對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以及RNA干擾的放射增敏作用，為探索新的食管癌治療方法提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1．3對(duì)靶向Bcl—2基因的siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并化學(xué)合成。<

7、br>　　 2．脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞株EC9706，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞中Bcl—2蛋白的表達(dá)。
　　 3．AnnexinV—FITC/PI雙染凋亡試劑盒檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組EC9706細(xì)胞凋亡率，觀察轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 4．AnnexinV—FITC/PI雙染凋亡試劑盒檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合X射線照射對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 5．平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察Bcl—2特異

8、性干擾siRNA對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)可以將Bcl—2—siRNA成功導(dǎo)入人食管癌細(xì)胞EC9706。
　　 2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果證實(shí)Bcl—2—siRNA轉(zhuǎn)染引起EC9707細(xì)胞中Bcl—2蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 3．與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組相比，Bcl—2—siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率明顯增加，說(shuō)明Bcl—2—siRNA可誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞EC970

9、6凋亡。
　　 4．Bcl—2 siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合X射線照射明顯增加人食管癌細(xì)胞EC9706的凋亡率。
　　 5．克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組相比，Bcl—2—siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活曲線明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 凋亡抑制基因Bcl—2特異性siRNA導(dǎo)入人食管癌EC9706細(xì)胞可以抑制Bcl—2蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)X射線照射的敏感