青蒿琥酯對(duì)白血病細(xì)胞β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　 我國(guó)白血病發(fā)病率為2.76/10萬(wàn),在惡性腫瘤死亡率中,白血病居第6位(男性)和第8位(女性),在兒童及35歲以下成人中則居第一位,且近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?？v觀近40年來(lái)急性白血病的治療進(jìn)展,盡管60～80％初發(fā)白血病患者(非M3)可獲得臨床完全緩解(CR),但是仍有大于50％的緩解患者在治療1～2年內(nèi)復(fù)發(fā),體內(nèi)的白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物出現(xiàn)耐藥,導(dǎo)致治療失敗。難治、殘留、復(fù)發(fā)仍然是白血病治療的巨大障礙和亟待解決

2、的難題。近年來(lái),砷劑在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用為中草藥抗腫瘤治療開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元,中草藥在世界醫(yī)學(xué)中的影響越來(lái)越大,開(kāi)發(fā)有效的天然抗腫瘤藥物成為腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。
　　 青蒿素類衍生物青蒿琥酯(Artesunate ART)能夠通過(guò)血腦屏障、高效、低毒、脂溶性好、抗瘧活性高等特性使之成為世界范圍的抗瘧疾首選藥。目前國(guó)內(nèi)外大量研究表明,其在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷作用,而對(duì)人體正常細(xì)胞作用輕微；且其與已知的傳統(tǒng)抗癌化療藥

3、如長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤、羥基脲等作用機(jī)制不同,因此可與傳統(tǒng)抗癌化療藥物合用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)ART可在體內(nèi)外抑制腫瘤血管形成,進(jìn)而干擾腫瘤微環(huán)境,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受抑,但其在分子水平的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。Efferth等用55種人源性腫瘤細(xì)胞系檢測(cè)青蒿琥酯的抗癌活性,發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞對(duì)其最為敏感。進(jìn)一步文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),白血病細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞存在一個(gè)共同特點(diǎn),即β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)失調(diào)。β-catenin

4、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活在維系干細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的分化、體軸的發(fā)育、細(xì)胞的不對(duì)稱分裂等許多生物發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,隨著對(duì)其在分子生物學(xué)領(lǐng)域作用研究的深入,研究發(fā)現(xiàn)β-catenin信號(hào)通路在淋巴細(xì)胞以及造血干細(xì)胞的發(fā)育中也具有重要作用,而且越來(lái)越多的證據(jù)表明這一途徑可能與維持白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell,LSC)的自我更新和增殖分化密切相關(guān)。
　　 在本課題組前期工作中,利用基因芯片技術(shù)研究了慢性髓系白血病(

5、chronic myeloid leukemia,CML)患者急變期和慢性期基因表達(dá)變化,并進(jìn)一步利用生物信息學(xué)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,結(jié)果發(fā)現(xiàn),wnt信號(hào)通路在CML疾病進(jìn)展過(guò)程中扮演了重要角色,其中β-catenin處于CML急變相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的核心位置。β-catenin蛋白是一個(gè)多功能蛋白,至少存在3種不同的細(xì)胞定位,可以發(fā)揮兩種相對(duì)獨(dú)立的生物學(xué)功能。正常細(xì)胞中,細(xì)胞膜上的β-catenin與E-cadherin

6、相互連接,維持上皮細(xì)胞的完整性；胞漿內(nèi)游離β-catenin水平較低,不能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控癌基因表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中,胞漿內(nèi)游離的β-catenjn異常積累,激活下游靶基因如c-myc、CyclinD1等基因轉(zhuǎn)錄,啟動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)程序；另一方面還會(huì)直接誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)缺失,從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
　　 E-cadh

7、erin是依賴Ca2+的細(xì)胞粘附分子超家族成員之一,表達(dá)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞,介導(dǎo)造血細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用,是骨髓微環(huán)境的重要組成部分。細(xì)胞膜上E-cadherin的表達(dá)缺失能使白血病細(xì)胞從彼此的連接中解離、遷移出來(lái),并破壞造血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),使白血病細(xì)胞獲得侵襲性表型,導(dǎo)致白血病細(xì)胞脫離其它細(xì)胞的黏附并進(jìn)一步分散和轉(zhuǎn)移。因此,β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因是介導(dǎo)白血病細(xì)胞與其微環(huán)境“crosstalk”的關(guān)鍵

8、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分子之一。
　　 因此我們猜測(cè),青蒿素的抗白血病活性可能與β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)。有必要深入探討β-catenin信號(hào)通路與白血病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及青蒿琥酯抗白血病活性是否與β-catenin信號(hào)通路相關(guān),為明確青蒿素衍生物的作用機(jī)理及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.挖掘CML急變相關(guān)基因,旨在進(jìn)一步探討CML急變機(jī)制。
　　 2.檢測(cè)白血病患者E-cadherin

9、和β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,并探討其臨床意義,旨在進(jìn)一步探討β-catenin通路相關(guān)基因在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 3.檢測(cè)青蒿琥酯作用前后白血病細(xì)胞內(nèi)E-cadherin和β-catenin蛋白定位的變化以及E-cadherin、β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的表達(dá)變化,初步探討青蒿琥酯對(duì)β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。為青蒿琥酯應(yīng)用于臨床提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

10、
　　 研究方案
　　 1.應(yīng)用生物信息學(xué)方法挖掘基因芯片數(shù)據(jù),探討CML急變可能涉及到的相關(guān)基因和信號(hào)通路。
　　 2.應(yīng)用Realtime-PCR法分別檢測(cè)75例初診AML患者、68例ALL患者和20例非惡性血液病(對(duì)照組)中E-cadherin和β-catenin mRNA的表達(dá),采用2-Δct法對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算,分析E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)與患者臨床特征和療效的關(guān)系。

11、r>　　 3.選取U937、K562和MOLT-4白血病細(xì)胞為研究對(duì)象,分別設(shè)濃度為0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml青蒿琥酯作用三種白血病細(xì)胞24h、48h和72h,MTT法檢測(cè)各組OD值,計(jì)算、比較各處理組細(xì)胞的增殖抑制率,并分別計(jì)算IC50值；Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化；Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；以確定青蒿琥酯對(duì)LJ937、K562和MOLT

12、-4白血病細(xì)胞的最佳處理?xiàng)l件。
　　 4.分別應(yīng)用半定量RT-PCR檢測(cè)U937、K562和MOLT-4白血病細(xì)胞系E-cadherin基因CDH1的表達(dá),并應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)CDH1是否處于甲基化狀態(tài)。
　　 5.濃度為0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml青蒿琥酯分別作用于U937、K562和MOLT-4細(xì)胞48h,應(yīng)用western-blotting方法檢測(cè)不同濃度ART作用下

13、三種細(xì)胞中E-cadherin、β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的表達(dá)變化,探討青蒿琥酯對(duì)β-eatenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。
　　 6.分別設(shè)濃度為0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml青蒿琥酯作用于U937、K562和MOLT-4細(xì)胞48h后,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察U937、K562和MOLT-4細(xì)胞中E-cadherin、β-eatenin蛋白定位的變化。
　　

14、 7.統(tǒng)計(jì)方法:應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析,E-cadherin、β-catenin mRNA表達(dá)在急性白血病患者和對(duì)照組不符合正態(tài)分布,用中位數(shù)描述。急性白血病與對(duì)照組、AML各亞型、ALL各亞型與對(duì)照組間及兩兩比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U檢驗(yàn)；AML各亞型間整體比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；E-cadherin、β-catenin mRNA表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系用spearman相

15、關(guān)性分析；E-cadherin、β-catenin基因高表達(dá)與低表達(dá)組間完全緩解率、難治白血病發(fā)生率、1年內(nèi)死亡率比較用x2檢驗(yàn),1年中位生存時(shí)間比較Log rank檢驗(yàn)；用Kaplan.Meier法進(jìn)行生存分析。細(xì)胞株E-cadherin、β-catenin表達(dá)以(x)+S描述,由于方差齊,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組內(nèi)多重比較用LSD法。藥物處理組及空白對(duì)照組細(xì)胞在增殖抑制率、凋亡方面的比較由于方差齊,采用單因素方差分析。以P

16、<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論
　　 1.利用DAVID軟件對(duì)基因芯片篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集聚類,發(fā)現(xiàn)粘附相關(guān)分子和。wnt通路與CML急變密切相關(guān),進(jìn)一步采用Genomatix軟件對(duì)各類基因集和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),可明確找出那些處于核心位置的基因和轉(zhuǎn)錄因子,其中β-catenin位于核心位置,表明wnt/β-catenin信號(hào)通路參與CML急變。
　　 2.急性白血病患者E-cadh

17、erin表達(dá)顯著低于非惡性血液病患者,β-catenin表達(dá)顯著高于非惡性血液病患者。
　　 3.E-cadherin、β-catenin基因表達(dá)水平與AML患者細(xì)胞遺傳學(xué)預(yù)后危險(xiǎn)度相關(guān),且與B-ALL患者中BCR/ABL融合基因密切相關(guān)；T-ALL患者的E-cadherin表達(dá)水平較B-ALL低,β-catenin表達(dá)水平較B-ALL高.
　　 4.β-catenin表達(dá)水平與AML患者LDH、骨髓原幼稚細(xì)胞比例呈正相

18、關(guān),與ALL患者初發(fā)WBC數(shù)呈正相關(guān),E-cadherin、β-catenin基因表達(dá)水平與髓外浸潤(rùn)密切相關(guān)；β-catenin高表達(dá)組難治性白血病發(fā)生率較高。
　　 5.青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)U937、K562、MOLT-4細(xì)胞凋亡,且呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　 6.E-cadherin在白血病細(xì)胞中不表達(dá)或極低表達(dá),可能與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)。
　　 7.青蒿琥酯可能通過(guò)恢復(fù)E-cadhefin蛋白的表達(dá),募集β-