重癥監(jiān)護病房產(chǎn)ESBLs細菌耐藥性的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，細菌耐藥的發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)；其中，革蘭氏陰性細菌產(chǎn)牛超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extencled spectrum β—lactamases，ESBLs)是導致其對新型廣譜抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要機制。近年國內(nèi)外研究顯示，重癥監(jiān)護病房(Intensive careunit，ICu)的感染病原菌中，非發(fā)酵菌所占比例逐漸升高，多重耐藥性明顯；但對ESBLs是否介入其耐藥產(chǎn)生機制尚缺乏

2、足夠的認識，且檢測手段有限。為此，本研究探索建立了能夠適用于包括非發(fā)酵菌在內(nèi)的ESBLs常規(guī)和分子牛物學檢測技術(shù)，并應(yīng)用于ICU病房感染病原菌產(chǎn)ESBLs的分子流行病學和耐藥機制研究；此外，還對該類細菌的耐藥特點、分子流行病學規(guī)律和醫(yī)院獲得性感染的危險因素進行了研究。 1．三種ESBLs檢測方法的比較研究 目的：比較美國臨床和實驗室標準委員會(CLSI)推薦的表型篩選和確認試驗、改良三維試驗和ESBLs基因型特異性P

3、CR法對臨床分離株進行ESBLs檢測的結(jié)果。 方法：收集2004年1-10月問，分離自ICU病房患者的深部痰的96株非重復(fù)的革蘭氏陰性桿菌，包括：銅綠假單胞菌30株、嗜麥芽窄食單胞菌22株、鮑曼氏不動桿菌18株、洋蔥伯克霍爾德氏菌11株、黃桿菌屬10株、奇異變形桿菌2株，陰溝腸桿菌3株。采用Vitek-32全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定。應(yīng)用采用美國臨床和實驗室標準委員會(CLSI)推薦的表型篩選和確認試驗、改良三維試驗和ES

4、BLs基因型特異性PCR法分別對上述臨床分離株進行ESBLs檢測，McNemar x<'2>檢驗和Kappa檢驗進行統(tǒng)計學分析，以評價3種ESBLs檢測方法的結(jié)果。 結(jié)果：CLSI法、改良三維試驗和PCR法對上述菌株的ESBLs檢出率分別為29.2％(28／96)、51.0％(49／96)和44.8％(43／96)。對CLSI法和改良三維試驗進行比較分析，檢測結(jié)果不一致部分兩者具有顯著性差異，改良三維試驗檢出率高于CLSI法(x

5、<'2>=7.55，P=0.005)；一致性檢驗提示高度不一致(K=0.095，P=0.303)。對CLSI法和PCR法進行比較分析，不一致部分兩者具有顯著性差異，PCR法檢出率高于CLSI法(x<'2>=4.170，P=0.040)；一致性檢驗提示高度不一致(K=-0.024，P=0.807)。將PCR方法的結(jié)果于改良三維試驗比較，兩者的檢出率沒有差別(x<'2>=1.042，P=0.307)；具有較好的一致性(K=-0.50l，P=

6、0.000)。 結(jié)論：改良三維試驗和PCR法可擴大ESBLs產(chǎn)酶菌種的檢測范圍，是對CLSI表型篩選和確認ESBLs試驗的重要補充，具有臨床應(yīng)用的前景。 2．ICU病房產(chǎn)ESBLs細菌分布、基因型及其耐藥性的研究 目的：探討應(yīng)用PCR和核酸測序等技術(shù)對重癥監(jiān)護病房革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)ESBLs的基因型鑒定，并對該組細菌的藥敏特點進行分析，以便指導臨床合理用藥，減少耐藥基因的產(chǎn)生。 方法：收集2003

7、年1月至2004年10月間，分離自ICU病房膿毒癥(Sepsis)患者下呼吸道分泌物的無重復(fù)臨床分離株，共202株。包括：嗜麥芽窄食單胞菌48株、銅綠假單胞菌45株、肺炎克雷伯氏菌31株、鮑曼氏不動桿菌26株、大腸埃希氏菌9株、洋蔥伯克霍爾德氏菌14株、黃桿菌屬11株，其它18株。采用Vitek-32全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定。并用改良三維試驗進行ESBLs產(chǎn)酶株的識別；PCR通用引物擴增SHV型、TEM型、CTx-M型和OXA型

8、等常見ESBLs基因，及其克隆測序鑒定ESBLs基因型。Kirhy-Bauer法進行受試菌的藥物敏感性分析。 結(jié)果：共納入研究患者88例，平均APACHEII評分為26.2l±9.24?？偟腅SBLs產(chǎn)酶株檢出率為51.5％(104／202)，依次為鮑曼氏不動桿菌80.8％(21／26)、肺炎克雷伯氏菌67.7％(21／31)、大腸埃希氏菌66.7％(6／9)、嗜麥芽窄食單胞菌41.7％(20／48)和銅綠假單胞菌33.3％(1

9、.5／45)等。PCR法檢測結(jié)果顯示，受試菌中SHV型基因檢出率為9.9％(20／202)、TEM型為8.4％(17／202)、CTX-M型為27.2％(55／202)和OXA型為1.0％(2／202)，以CTX-M型ESBLs最為常見。藥敏分析顯示，EsBLs產(chǎn)酶株具有多重耐藥性，且對常用抗菌藥物的耐藥率明顯高于ESBLs陰性株(P<0.05)。 結(jié)果：ICU病房患者下呼吸道感染革蘭陰性菌以非發(fā)酵菌最為常見，且ESBLs檢出率

10、高，提示ESBLs為其重要耐藥機制；ESBLs基因型以CTX-M型最為常見；ESBLs產(chǎn)酶株對常用抗菌藥物的耐藥率明顯增高。 3．ICU病房產(chǎn)ESBLs銅綠假單胞菌的分子流行病學研究 目的：探討應(yīng)用分子流行病學方法對ICU病房產(chǎn)ESBLs銅綠假單胞菌的基因同源性進行分析，了解院內(nèi)爆發(fā)感染的可能性。 方法：對7株銅綠假單胞菌分離自2004年6月至2004年8月問ICu病房的重癥患者，經(jīng)改良三維試驗證實均產(chǎn)E

11、SBLs。遂采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)進行菌株的DNA克隆分析，以了解是否存在產(chǎn)ESBLs銅綠假單胞菌醫(yī)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。Kirby-Bauer法進行藥物敏感性分析。 結(jié)果：PFGE技術(shù)分析顯示，7株產(chǎn)ESBLs銅綠假單胞菌中，6株菌的DNA PFGE條帶基本一致，定為A型株，且具有相似的耐藥譜特征，提示為同一克隆株。該克隆株對包括亞胺培南在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥，僅對阿米卡星敏感。 結(jié)論：我院ICu

12、病房存在產(chǎn)ESBLs銅綠假單胞菌克隆株醫(yī)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行，且為多藥耐藥株，給臨床抗感染治療帶來困難。本研究通過建立PFGE DNA克隆分型技術(shù)，為監(jiān)測和控制該類耐藥菌醫(yī)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行提供重要的技術(shù)手段和理論依據(jù)。 4．ICU病房銅綠假單胞菌醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)的流行病學研究 目的：探討應(yīng)用傳統(tǒng)流行病學方法與分子流行病學方法結(jié)合在ICu病房銅綠假單胞菌院內(nèi)感染 方法：對2003年3月至2005年2月問ICU病房

13、患者感染的微生物學和臨床資料進行回顧性分析，以了解銅綠假單胞菌醫(yī)院內(nèi)感染的變化趨勢。進而實施現(xiàn)場取樣調(diào)查，以了解患者就醫(yī)環(huán)境和醫(yī)護人員攜帶銅綠假單胞菌的情況。并對分離到的銅綠假單胞菌進行PFGE DNA克隆分型，判斷克隆株的流行情況。 結(jié)果：普通病房銅綠假單胞菌的分離率為7．7％，ICU病房為17．5％(P－0．000，OR值2．534；95％可信區(qū)問2．141，2．999)。ICU病房銅綠假單胞菌的分離率由非暴發(fā)期的15．7％

14、上升到暴發(fā)期的25．5％(P=0．000；OR值1．837；95％可信間 1．377，2．451)。ICU病房患者的銅綠假單胞菌的感染率由非暴發(fā)期的18．0％上升到暴發(fā)期的40．0％(P=0．000：OR值3．037；95％可信區(qū)間1．672，5．516)。對從20名重癥者分離的銅綠假單胞菌進行PFGE分型，共獲得6種PFGE分型，其中12株為A型。采取防治措施后，2004年8月ICU病房銅綠單胞菌的分離率和感染率分別回降至8．5％和1